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目的和意义：原发性肝癌是世界上最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和病死率在恶性肿瘤中均位居前列[1]。原发性肝癌对我国人群健康危害非常巨大，目前以手术切除为主的综合治疗的总体疗效不佳，其5年生存率仅有5%左右。辅助化疗疗效不佳是主要治疗困难之一，其主要是由于原发性肝癌的多药耐药（multiple drug resistance，MDR）所致[2]。研究表明，肝癌的发生、发展是涉及多基因、多因素、多步骤的一个过程，癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因等众多基因的异常激活或异常失活是肝癌发生的分子基础[3]，而其包括化疗耐药在内的多种临床生物学行为则是多种拮抗/促进因子平衡紊乱的结果[4]。通过基因学操作在分子水平上干预发生紊乱的平衡可能是解决肝癌多药耐药的关键。在前期的研究中，我们已经发现一条功能未知的基因BC047440[5]，其在肝癌组织中呈高表达，且与肝癌的恶性程度呈正相关[6]，本实验利用RNAi技术，采用慢病毒介导HepG2/ADM细胞系BC047440基因沉默，建立BC047440RNA干扰模型，观察沉默BC047440基因后对HepG2/ADM细胞生物学特性的影响，并进一步检测BC047440沉默后相关基因在蛋白及mRNA水平的变化，初步探讨慢病毒介导shRNA沉默BC047440基因逆转HepG2/ADM化疗耐药性的作用机制，为进一步的肝癌基因治疗打下基础。方法：1．以适当滴度的慢病毒颗粒BC047440-shRNA及Control-shRNA感染HepG2/ADM细胞，培养48、72h后在普通光镜及对应荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光表达，选择细胞状态较好、绿色荧光表达率较高、强度较强的MOI值作为最适MOI值，并以此建立BC047440RNA干扰模型。2．实验分为BC047440-shRNA组、 control-shRNA组及HepG2/ADM组，其中BC047440-shRNA组、control-shRNA组分别加入对应重组慢病毒及对照空白慢病毒，HepG2/ADM组只加培养基，培养96h后提取各组HepG2/ADM细胞总蛋白行WesternBlotting检测BC047440蛋白变化。3．实验分组同方法2，以阿霉素终末浓度2.5ug/ml培养各组细胞。分别于培养后24h、48h、72h采用CCK-8于酶联免疫检测仪测定波长460nm的吸光度值[D（460）]，计算其生长抑制率。4．实验分组同方法2，取各组对数生长期细胞，培养48h后，用流式细胞仪检测、分析细胞周期分布的变化。各组细胞以终末浓度为0.04ug/ml的阿霉素作用48h后，于流式细胞仪检测细胞凋亡率。5．实验分组同方法2，培养96h后提取各组细胞总蛋白及总RNA，Western Blotting检测各组NF-κB蛋白表达变化，Real time PCR检测各组细胞Survivin、CCNL1基因mRNA表达变化。结果：1．成功建立BC047440RNA干扰模型； Western Blotting检测提示培养96h后BC047440-shRNA组BC047440蛋白的相对表达量（0.353±0.009）较control-shRNA组（1.159±0.042）及HepG2/ADM组（1.205±0.019）降低，其差异具有统计学意义（P﹤0.05），control-shRNA组与HepG2/ADM组BC047440蛋白相对表达量的差异无统计学意义（P﹥0.05）；BC047440-shRNA组BC047440蛋白抑制率为71.5%。2．培养24h、48h后阿霉素对BC047440-shRNA组细胞生长抑制作用（生长抑制率24h为0.593±0.317、48h为0.846±0.017）较control-shRNA组（生长抑制率24h为0.355±0.027、48h为0.527±0.029）及HepG2/ADM组（生长抑制率24h为0.341±0.027、48h为0.518±0.025）增强，其差异具有统计学意义（P﹤0.05）；培养72h后阿霉素对各组细胞生长抑制作用差异无统计学意义（P﹥0.05）。3．流式细胞技术结果显示BC047440-shRNA组细胞凋亡高于control-shRNA组及HepG2/ADM组，细胞周期多阻滞于S期，而control-shRNA组与HepG2/ADM组细胞周期则主要阻滞于G0/G1期。4．Western Blotting检测NF-κB蛋白的相对表达量，以β-actin为参照，提示培养96h后BC047440-shRNA组NF-κB蛋白的相对表达量（0.196±0.006）低于control-shRNA组（0.526±0.009）及HepG2/ADM组（0.552±0.023）表达降低，其差异具有统计学意义（P﹤0.05），control-shRNA组与HepG2/ADM组NF-κB蛋白相对表达量的差异无统计学意义（P﹥0.05）；BC047440-shRNA组NF-κB蛋白抑制率为67.39%。5．Real time PCR检测Survivin基因mRNA的相对表达量，以β-actin为参照，BC047440-shRNA组Survivin基因mRNA的相对表达量(2-Δct=0.018±0.001)较control-shRNA组(2-Δct=0.0415±0.0015)及HepG2/ADM组(2-Δct=0.048±0.002)降低，其差异具有统计学意义（P<0.05），control-shRNA组与HepG2/ADM组Survivin基因mRNA相对表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），BC047440-shRNA组Survivin基因mRNA相对表达量约为control-shRNA组的37%，约为HepG2/ADM组的42%；检测CCNL1基因mRNA的相对表达量，以β-actin为参照， BC047440-shRNA组CCNL1基因mRNA的相对表达量(2-Δct=0.0995±0.0035)较control-shRNA组(2-Δct=0.0285±0.0015)及HepG2/ADM组(2-Δct=0.0415±0.0015)升高，其差异具有统计学意义（P<0.05），control-shRNA组和HepG2/ADM组CCNL1基因mRNA相对表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），BC047440-shRNA组CCNL1基因mRNA的相对表达量约为control-shRNA组3.5倍，约为HepG2/ADM组2.4倍。结论：1．成功建立HepG2/ADM细胞的BC047440RNA干扰模型。2．沉默BC047440基因可部分逆转HepG2/ADM细胞对阿霉素的耐药性，阻滞HepG2/ADM细胞周期于S期、促进HepG2/ADM细胞凋亡并增加其细胞生长抑制率。3．沉默BC047440基因逆转HepG2/ADM细胞MDR可能是通过BC047440对NF-κB信号通路及肿瘤凋亡、细胞周期相关基因Survivin、CCNL1的调控来实现。