脐血以其采集方便、干细胞含量丰富、GVHD发生率低而成为造血重建的重要干细胞来源。但单份脐血所含的造血细胞数往往仅能用于儿童和低体重成人患者，脐血的体外扩增有望克服这一障碍，但扩增后脐血造血细胞的植入能力是否受到影响，造血重建能力能否得以维持是国内外学者和临床医生关注的热点。 本实验室以往的研究证实了以脐血单个核细胞(MNC)为起始培养细胞不仅减少细胞损失简化实验操作，而且能够实现有效的扩增，为此我们继续探讨脐血MNC扩增后移植动物的情况，尝试寻找一套扩增后脐血应用于临床移植的完整可行方案。目的探讨脐血MNC在体外扩增后植入能力的改变以及对NOD/SCID小鼠造血重建的影响，寻找扩增后脐血应用于临床移植的可行方法。 材料与方法： 1.脐血来源：采自足月正常分娩的健康产妇后ACD-A抗凝，共采集10例，均来源广州医学院附属广州市第一人民医院妇产科和广东省人民医院妇产科。 2.动物与饲养：6～8周龄NOD/SCID小鼠36只，购自中山大学实验动物中心，饲养于该中心无特定病原体(SPF)环境。 3.脐血MNC的分离与液体悬浮培养：脐血采集6小时内用HES联合FicollHypaque密度梯度离心法提取MNC，按1×106/ml接种于含无血清培养基的50ml培养瓶中，在5％CO2，37℃及饱和湿度条件下连续培养14天。按细胞因子组合的不同分组如下：A组：空白对照，不加任何细胞因子；B组：加入SCF、FL和IL6；C组：加入SCF、FL、IL-6和IL-3。分别在培养的0天，6天，10天，14天取出少量细胞用于计数细胞总数，CD34+、CD34+38-细胞百分含量检测及CFU、CFU-GEMM集落培养。 4.造血祖细胞集落培养：将细胞按2×105/ml接种到含甲基纤维素半固体培养基的24孔板中，置5％CO2，37℃及饱和湿度的培养箱中培养14天，计数CFU，培养至21天时，计数CFU-GEMM。 5.凋亡标记AnnexinV的检测：严格按AnnexinV试剂盒说明书操作处理0.5×105个MNC，流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。 6.人脐血细胞移植NOD/SCID小鼠：36只NOD/SCID小鼠给予250cGy的半致死剂量照射(6WVX射线加速器)，照射率300cGy/min，照射后4小时内从尾静脉注入200μl生理盐水或MNC悬液(含5×106细胞)。实验分组：扩增组：18只输注C组扩增后脐血细胞；未扩增组：9只输注等量新鲜脐血MNC；空白对照组：9只输注200μl生理盐水。移植后观察小鼠存活情况，6周后处死存活小鼠，收集其外周血和四肢骨的骨髓细胞，脾、胸腺细胞。 7.存活小鼠的人源性细胞表面标志分析：流式细胞仪检测存活小鼠四肢骨骨髓细胞的CD45+、CD34+、CD3+、CD19+、CD33+的含量，脾、胸腺细胞的CD45+、CD34+、CD3+、CDi的含量，抗体按产品说明书方法标记上机检测。 8.人特异的Cart-Ⅰ基因、Alu基因检测：提取新鲜脐血细胞基因组DNA为阳性对照，正常NOD/SCID外周血基因组DNA为阴性对照，β-actine作内参照。扩增Cart-Ⅰ基因、Alu基因和β-actine基因的反应体系和条件相同。扩增产物以20g/L琼脂糖凝胶电泳分析结果。 10.统计学分析：实验数据以x±s表示，所有数据均采用SPSS10.0软件分析，统计方法为ANOVA、chi-squaretest和IndepententSamplesT-test，P＜0.05为显著性差异。 结果： 1.不同细胞因子组合对脐血MNC体外扩增的作用：与对照组(A组)相比扩增组(B，C组)具有明显扩增优势，尤其C组无论是细胞总数，CD34+细胞含量，CFU数还是代表HSC和较为早期的HPC的CD34+38-细胞含量和CFU-GEMM数均显著优于其他组(P＜0.05)，扩增高峰集中于6～10天，d10的细胞总数达9×106个，CD34+细胞，CD34+38-细胞从d0的1.34％，0.99％分别扩增至d6的5.45％，3％，CFU和CFU-GEMM也有大幅度增殖，从起始的111个和113个扩增至d10分别达到1033和439个集落的高峰。 2.不同细胞因子组合对脐血MNC凋亡的影响：含有细胞因子支持的两组，细胞表面AnnexinV的表达显著低于对照组，尤其是含有IL-3的C组细胞在培养后各时间点的凋亡率均低于A、B两组，具有显著差异性(P＜0.05)。 3.存活状况：空白对照组小鼠均在1周内死亡存活率为0，未扩增组小鼠存活率33.3％，扩增组小鼠存活率55.6％，其余均在移植后2～3周内死亡，扩增组与未扩增组小鼠的6周存活率无统计学差异(P＞0.05)。 4.NOD/SCID小鼠中人的造血细胞植入证据： 4.1小鼠骨髓、脾和胸腺细胞中人类白细胞抗原CD45的表达：在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓、脾和胸腺细胞中我们均能检出人CD45+细胞，骨髓中扩增组(0.42～2.13)％，未扩增组(0.1～0.96)％，说明存活的小鼠均获得脐血造血细胞的植入，扩增组与未扩增组无显著性差异(P＞0.05)。 4.2小鼠外周血细胞中人Alu基因、Cart-Ⅰ基因的表达：移植后存活6周的小鼠外周血细胞与阳性对照相同，扩增出224bp和156bp的特异性条带，表明存在人的造血细胞。13只存活的NOD/SCID小鼠均能检测到人的Alu基因、Cart-Ⅰ基因。阴性对照组小鼠未检测到任何特异性条带。 5.NOD/SCID小鼠的造血免疫重建：在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓、脾和胸腺细胞中我们均能检出人CD33+、CD34+、CD3+、CD19+细胞，反映人脐血造血细胞已在小鼠体内植入，并开始重建多系造血，其中扩增组小鼠骨髓中检出代表造血干/祖细胞的人CD34+细胞、髓系的人CD33+细胞、B淋巴细胞的人CD19+细胞分别为(0.99±0.65)％、(1.30±0.95)％和(0.64±0.60)％，显著高于未扩增组(P＜0.05)。另外扩增组10只存活小鼠中，8只可在胸腺、脾脏中分别检测到人T细胞CD3抗原(0.15～1.56)％，人B细胞CD19抗原(0.03～1.59)％，说明扩增的脐血造血细胞有助于免疫功能重建。 结论： 1.脐血MNC在无基质无血清培养条件下协同SCF、FL、IL-6和IL-3细胞因子进行短期培养，可实现有效的体外扩增，扩增效果以SCF+FL+IL-6+IL-3的组合为最佳。 2.体外扩增的6～10天是收获细胞的最好时间。 3.短期培养下IL-3协同SCF、FL和IL-6有助于减少脐血MNC凋亡。 4.脐血MNC有效扩增6天后能成功植入NOD/SCID小鼠体内。 5.以相同细胞数移植NOD/SCID小鼠，扩增后脐血的移植效果并不差于新鲜脐血移植，并帮助小鼠重建多系造血。