转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族通过TGF-β/Smads信号转导通路发挥生物学效应,在肿瘤的发生发展中起重要作用。TGF-β/Smads通路中任一元件的异常都可导致信号转导的紊乱,影响TGF-β的细胞生物学效应,尤其是失去了对细胞的生长抑制效应,促进肿瘤的发生和发展,但是针对不同的肿瘤类型,TGF-β/Smads通路中关键基因的缺失及失活机制不同。流行病学调查显示,20世纪80年代以来,贲门癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)的发病呈不断上升趋势,但迄今为止,贲门癌发生的分子机制并不十分明确。因此,深入研究此信号转导通路中关键基因在贲门腺癌中的作用将会为揭示贲门腺癌的发病机制提供分子生物学依据。本研究首先从转录水平和蛋白水平检测了贲门腺癌组织中TGF-β1、TGF-β受体1和受体2(TGF-βreceptor typeⅠ和typeⅡ, TGFBR1和TGFBR2)、Smad2、Smad3、Smad4禾(?)Smad7的表达及其与各临床指标及生物学行为的关系；其次,从遗传学的角度入手,检测了TGF-β1基因启动子区C-509T、G-800A、C-988A和外显子区T869C、G915C和C788T位点,TGFBR1 Int7G24A和*6A位点及TGFBR2 G-875A位点在贲门腺癌和健康人群中的频率分布,探讨这些SNP(single nucleotide polymorphisms)位点与贲门腺癌易感性的关系；然后,检测了贲门腺癌及上皮内瘤变组织中TGFBR1、TGFBR2和Smad4基因CpG岛的甲基化状态,并进一步分析了甲基化与基因mRNA和蛋白表达水平之间的关联性。主要研究内容和结果如下：第一部分：TGF-β/Smads信号转导通路关键基因在贲门腺癌组织中的表达目的：研究贲门腺癌中TGF-β/Smads信号通路关键基因TGF-β1及其受体(TGFBR1和TGFBR2)、Smads基因包括受体调节型Smads(Smad2和Smad3)、通用调节型Smad4和抑制型Smad(Smad7)在转录和蛋白水平上的改变,明确此通路中各关键基因在贲门腺癌发生发展中的作用。方法：应用半定量RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)的方法检测贲门腺癌中TGF-β1、TGFBR1、TGFBR2、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表达,采用免疫组织化学方法检测贲门腺癌中TGF-β1、TGFBR1、TGFBR2、p-Smad2/3、Smad4及Smad7的蛋白表达。结果：1 GCA组织中TGF-β1的mRNA表达水平显著高于相应的正常组织(0.8494±0.3024 vs.0.3879±0.1754,P<0.01),其蛋白表达水平亦显著高于相应的正常组织(P<0.01)。且Ⅲ、Ⅳ期GCA患者的TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者,随肿瘤组织分化程度的降低,TGF-β1在GCA组织中的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)2 GCA组织中TGFBR1的mRNA表达水平显著低于相应的正常组织(0.4015±0.1758 vs.0.9064±0.2925,P<0.01),其蛋白表达水平亦显著低于正常组织(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ期GCA患者TGFBR1的mRNA和蛋白表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)。3 GCA组织中TGFBR2的1nRNA表达水平显著低于相应的正常组织(0.3879±0.1205 vs.0.8917±0.2765,P<0.01),其蛋白表达水平亦显著低于正常组织(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ期GCA患者TGFBR2的mRNA和蛋白表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05),随着肿瘤组织分化程度的降低,TGFBR2蛋白阳性表达率逐渐降低(P<0.05)。4 GCA组织中Smad2和Smad3的1nRNA表达水平显著低于相应的正常组织(0.4956±0.1862 vs.0.8611±0.2914和0.4713±0.1712 vs.0.8314±0.2811,P<0.01)。GCA组织p-Smad2/3的蛋白表达阳性率为42.7%,显著低于相应正常组织的蛋白表达(93.6%)(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ期GCA患者p-Smad2/3蛋白表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期患者,随肿瘤组织分化程度的降低,p-Smad2/3蛋白阳性表达率逐渐降低(P<0.05)5 GCA组织中Smad4的mRNA表达水平显著低于相应的正常组织(0.5145±0.1987 vs.0.8954±0.2856,P<0.01),其蛋白表达水平亦显著低于正常组织(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ期GCA患者Smad4基因蛋白表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期患者,且随肿瘤组织分化程度的降低, Smad4蛋白阳性表达率逐渐降低(P<0.05)6 GCA组织中Smad7的mRNA表达水平显著高于相应的正常组织(0.5114±0.1962 vs.0.2012±0.1006,P<0.01),其蛋白表达水平亦显著高于相应的正常组织(P<0.01)。随肿瘤组织分化程度的降低,Smad7蛋白阳性表达率逐渐增高(P<0.05)7 GCA中TGF-β/Smad信号转导通路多个基因蛋白表达的联合分析显示,TGFBR1和TGFBR2之间、p-Smad2/3和Smad4之间、TGF-β1和Smad7之间、TGFBR1和p-Smad2/3之间呈正相关,(r分别为0.74、0.84、0.24和0.38,P值均<0.05)；TGF-β1和TGFBR1之间、TGF-β1和p-Smad2/3之间、TGFBR1和Smad7之间呈负相关(r分别为-0.54、-0.49和-0.22,P值均<0.05)；p-Smad2/3和Smad7之间无明显的相关性(r=-0.09,P>0.05)。结论：1 GCA组织中TGF-β1和Smad7的过表达可能与GCA的浸润转移密切相关。2 GCA组织中TGFBR1、TGFBR2、Smad2、Smad3 (p-Smad2/3)和Smad4的低表达可能与GCA的发生密切相关。3联合分析显示,GCA中TGFBR1和TGFBR2、p-Smad2/3和Smad4、TGF-β1和Smad7、TGFBR1和p-Smad2/3之间的蛋白表达呈明显的正相关,TGF-β1和TGFBR1、TGF-β1和p-Smad2/3、TGFBR1和Smad7之间呈负相关,p-Smad2/3和Smad7之间无明显的相关性。提示TGF-β受体、R-Smad和Smad4基因任何一种发生改变,均可使肿瘤细胞失去对TGF-β1的敏感性而发生不受控的异常增殖。第二部分：TGF-β1及其受体1和受体2基因多态性与贲门腺癌易感性目的：通过病例对照研究探讨TGF-β1基因C-509T、G-800A、C-988A、T869C、G915C和C788T,TGFBR1基因Int7G24A和*6A以及TGFBR2基因G-875A等SNP位点与贲门腺癌遗传易感性的关系。方法：分别应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)、聚合酶链反应-引物引入限制性内切酶分析(polymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis, PCR-PIRA)、聚合酶链反应-扩增阻滞突变技术(polymerase chain reaction-amplification refractory mutation system,PCR-ARMS)、PCR产物长度分析等方法进行基因分型,采用ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)方法检测贲门腺癌患者及健康对照的TGF-β1血浆水平,采用TUNEL与免疫组化双标方法检测贲门腺癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡情况。结果：1 GCA组中UGIC家族史阳性个体比例为36.8%,显著高于健康对照组的5.1%,表明UGIC家族史可能增加GCA的发病风险(校正后的OR=10.61,95%CI=7.64.12.28)。2 GCA组TGF-β1基因-509T等位基因型频率(52.4%)显著高于健康对照组(44.0%)(P<0.01),与CC基因型相比,携带CT或TT基因型可显著增加GCA的发病风险(校正后OR分别为1.67和1.89,95%C1分别为1.17-2.45和1.25-2.71)。分层分析发现：与CC基因型相比,携带CT或TT基因型可显著增加非吸烟人群患GCA(校正后OR分别为1.97和2.33,95%C1分别为1.28-2.87和1.61.3.01)、家族史阴性人群患GCA(校正后OR分别为1.76和1.97,95%C1分别为1.25-2.67和1.10-2.89)及Ⅲ、Ⅳ期GCA的发病风险(校正后OR分别为1.94和2.35,95%C1分别为1.40-2.57和1.67-2.89)。3 GCA组TGF-β1基因869C等位基因型频率(53.3%)显著高于健康对照组(45.5%)(P<0.01),与TT基因型相比,携带TC或CC基因型可显著增加GCA的发病风险(校正后的OR分别为1.65和1.85,95%C1分别为1.15-2.41和1.21.2.69)。分层分析发现：与TT基因型相比,携带TC或CC基因型可显著增加非吸烟人群患GCA(校正后OR分别为1.98和2.07,95%C1分别为1.31-2.89和1.45.2.91)、家族史阴性人群患GCA(校正OR=1.72和1.87,95%CI=1.23-2.61和1.19-2.78)及Ⅲ期和Ⅳ期GCA的发病风险(校正后OR=1.90和2.07,95%CI=1.47-2.56和1.54-2.69)。4 TGF.β1基因G-800A、C-988A、G915C和C788T多态性位点的突变等位基因型均较低,它们的基因型及等位基因型频率在GCA组和健康对照组之间,其分布均无显著性差异(P>0.05)。5 TGF.β1基因C-509T和T869C两个位点处于强连锁不平衡状态(D’=0.94)。单体型分布显示,与-509C/869T相比,.509T/869C单体型可显著增加GCA的发病风险(校正OR=1.92,95%CI=1.38-2.59)。6功能分析显示：携带TGF-β1基因C-509T位点CC基因型的GCA患者TGF-β1水平及蛋白表达阳性率均明显低于携带TT或CT+TT基因型的GCA患者,携带TGF-β1基因T869C位点TT基因型的GCA患者TGF-β1水平及蛋白表达阳性率均明显低于携带CC或TC+TT基因型的GCA患者。与携带TGF-β1 -509TT和869CC基因型的GCA患者相比(29.8±1.8%),携带.509CC和869TT基因型的GCA患者其凋亡肿瘤浸润淋巴细胞率显著降低(17.3%士1.7%,P<0.05),而杂合型基因携带者无明显差异(25.4±1.5%,P>0.05)。7 GCA组TGFBR1基因Int7G24A多态性位点的A等位基因携带者患GCA的风险是G等位基因的1.34倍(校正后的OR=1.34,95%CI为1.03-1.87)。与GG基因型相比,携带GA和AA基因型可显著增加GCA的发病风险(校正后的OR为1.34,95%CI为1.02-1.73)。与GG基因型相比,Ⅲ期和Ⅳ期GCA中携带GA和AA基因型可显著增加发病风险(校正OR=1.41,95%CI=1.05-1.98)。TGFBR1基因*6A多态性位点的基因型及等位基因型频率在GCA组和对照组之间,其分布均无显著性差异(P>0.05)。Int7G24A和*6A两个多态性位点的基因型与TGFBR1在GCA中的表达没有明显的相关性。8与TGFBR2基因G-875A位点的G等位基因相比,携带A等位基因可使GCA的发病风险降低约30%(校正后的OR=0.73,95%CI为0.49-0.92)。与GG基因型相比,携带GA和AA基因型可显著降低GCA的发病风险(校正后的OR为0.71,95%CI为0.52-0.95)。与GG基因型相比,Ⅲ期和Ⅳ期GCA患者中携带GA和AA基因型可显著降低GCA的发病风险(校正OR=0.70,95%CI=0.47-0.92)。G-875A基因型与TGFBR2在GCA中的表达没有明显的相关性。9与保护性基因型组合-509CC.Int7GG..875AA相比,仅一个位点携带易感基因(杂合子或纯合子)的个体患GCA的风险升高1.31倍(校正OR=1.31,95%CI=1.02-1.58),当两个位点同时存在易感等位基因时,个体患GCA的风险升高1.54倍(校正OR=1.54,95%CI=1.21-1.85),而当三个位点同时存在易感等位基因时可使GCA的风险升高2.05倍(校正OR=2.05,95%CI=1.52-2.61)。趋势性检验显示,携带易感等位基因位点的个数越多,GCA的发病风险越高(x2趋趋=21.843,P趋势<0.01)。结论：1上消化道肿瘤家族史明显增加GCA的发病风险。2与TGF-β1-509CC基因型相比,携带CT或TT基因型可显著增加GCA的发病风险,与TGF-β1869TT基因型相比,携带TC或CC基因型可显著增加GCA的发病风险,并且在Ⅲ、Ⅳ期GCA患者中此作用更加明显。携带-509CC或869TT基因型的GCA患者其TGF-β1水平、蛋白表达及凋亡肿瘤浸润淋巴细胞率均显著降低。TGF-β1C-509T和T869C两个位点处于强连锁不平衡,与一509C/869T相比,-509T/869C单体型可显著增加GCA的发病风险。3 TGF-β1基因G-800A、C-988A、G915C和C788T多态性位点与GCA的发病风险无关。4与TGFBR1基因Int7G24A多态性位点的GG基因型相比,携带GA和AA基因型可显著增加GCA的发病风险,并且在Ⅲ、Ⅳ期GCA患者中此作用更加明显。TGFBR1基因*6A多态性位点与GCA的发病风险无关。Int7G24A和*6A多态性位点与TGFBR1的蛋白表达无明显相关。5与TGFBR2基因G-875A多态性位点的GG基因型相比,携带GA和AA基因型可显著降低GCA的发病风险。但此位点与TGFBR2的蛋白表达无明显相关。6与保护性基因型组合-509CC-Int7GG--875AA相比,携带易感等位基因位点的个数越多,GCA的发病风险越高。第三部分：贲门腺癌中TGF-p受体1、受体2及Smad4基因甲基化状态分析目的：探讨贲门腺癌中TGFBR1、TGFBR2和(?)Smad4基因的甲基化状态及其与mRNA和蛋白表达的相关性,为确定此三种基因甲基化在责门腺癌发生发展中的作用提供理论依据。方法：应用甲基化特异性聚合酶链式反应方法(methylation specific polymerase chain reaction, MSP)检测贲门腺癌及上皮内瘤变组织中TGFBR1、TGFBR2及Smad4的甲基化状态,并分析其与各临床指标及生物学行为的关系。结果：1 TGFBR1基因在正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变及GCA组织中的甲基化率分别为1.8%(2/110)、3.8%(1/26)、11.4%(4/35)和30.9%(34/110)。高级别上皮内瘤变及GCA组织中TGFBR1基因发生甲基化的比率显著高于正常组织(P<0.05)。Ⅲ期和Ⅳ期GCA患者癌组织中TGFBR1基因发生甲基化的比率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。2 TGFBR1基因甲基化阳性的GCA组织其mRNA表达显著低于未发生甲基化的GCA组织(0.1816士0.0816 vs.0.6514±0.2187,P<0.01)。发生TGFBR1高甲基化的肿瘤组织蛋白表达均为阴性,TGFBR1基因启动子区的甲基化与其蛋白表达缺失之间有明显的相关性(P<0.01)。3 TGFBR2基因-25和-140位点的甲基化率在正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变及GCA组织中相同,分别为3.6%(4/110)、7.7%(2/26)、25.7%(9/35)和47.3%(52/1 10)。高级别上皮内瘤变及GCA组织中TGFBR2基因发生甲基化的比率显著高于正常组织(P<0.01),Ⅲ期和Ⅳ期GCA患者中TGFBR2基因发生甲基化的比率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05),高、中、低分化的肿瘤组织发生甲基化的比率亦有显著性差异(P<0.05),分化程度越低,甲基化率越高。4 TGFBR2基因甲基化阳性的GCA组织其mRNA表达显著低于未发生甲基化的GCA组织(0.1745士0.0756 vs.0.5894±0.2061,P<0.01)。发生TGFBR2高甲基化的52例肿瘤组织中有47例蛋白表达为阴性,TGFBR2基因启动子区的甲基化与其蛋白表达缺失有明显的相关性(P<0.01)。5对于-248-26位点,GCA组织中Smad4的甲基化率为5.5%,而相应正常粘膜及上皮内瘤变组织均未检测到甲基化,癌组织Smad4基因-248-26位点甲基化率显著高于正常组织(P<0.05)。对于30-171位点,高级别上皮内瘤变和GCA组织Smad4的甲基化率分别为8.6%(3/35)和24.5%(27/110),相应正常粘膜及低级别上皮内瘤变组织均未检测到甲基化。高级别上皮内瘤变及癌组织Smad4基因30-171位点甲基化率显著高于正常组织(P<0.05)。Ⅲ期和Ⅳ期GCA患者中Smad4基因此位点发生甲基化的比率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05),高、中、低分化肿瘤组发生甲基化的比例亦有明显差异(P<0.05),分化程度越低,其甲基化率越高。6对于-248-26位点,发生甲基化的GCA组织其Smad4基因mRNA和蛋白表达与未发生甲基化的GCA组织相比无显著性差异；对于30-171位点,甲基化阳性的GCA组织其Smad4基因mRNA表达显著低于未发生甲基化的GCA组织(0.2987士0.0925 vs.0.6415±0.2814,P<0.01),且发生30-171区域高甲基化的27例GCA组织有24例(?)Smad4蛋白表达为阴性,其甲基化与蛋白表达缺失之间有明显的相关性(P<0.01)。7贲门腺癌中TGFBR1、TGFBR2及Smad4基因甲基化状态的联合分析显示,随着肿瘤分期的增高,至少一个基因发生甲基化、至少两个基因同时发生甲基化及三个基因同时发生甲基化的比率明显增加(P值均<0.05)当按病理分级进行分析时,随着肿瘤组织分化程度的降低,至少一个基因发生甲基化的比率呈现升高趋势,但无统计学差异(P>0.05)。至少两个基因同时发生甲基化及三个基因同时发生甲基化的比率则有明显差异,随着肿瘤组织分化程度的降低,甲基化率逐渐增加(P<0.05)。结论：1高级别上皮内瘤变及GCA组织中TGFBR1基因发生甲基化的比率显著高于正常组织,且TGFBR1在GCA中的甲基化与肿瘤临床分期有关,与组织分化无关。GCA中TGFBR1基因启动子区的甲基化与其mRNA和蛋白表达缺失之间有明显的相关性。2 TGFBR2基因.25和.140位点的甲基化率在正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变及GCA组织中相同,高级别上皮内瘤变及癌组织中TGFBR2基因发生甲基化的比率显著高于正常组织,且TGFBR2在GCA中的甲基化与肿瘤临床分期和分化有关。GCA中TGFBR2基因启动子区的甲基化与其mRNA和蛋白表达缺失之间有明显的相关性。3对于Smad4基因,GCA中30-171位点的甲基化率高于-248-26位点,且与GCA的肿瘤分期和分化有关。对于30-171位点,其甲基化与GCA组织的mRNA和蛋白表达缺失之间有明显的相关性。4 TGFBR1、TGFBR2及Smad4三种基因甲基化的联合检测有助于贲门腺癌的预后及进展的判断。