论文部分内容阅读
脑缺血后能量代谢的失常是神经元死亡的始动因子,近年大量研究表明,脑缺血/再灌注后引起脑神经细胞线粒体功能障碍,包括氧自由基损伤、钙超载、线粒体膜电位的改变、线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeabilitytransition pore,MPTP)异常开放、线粒体结构损伤等。线粒体作为高度动态变化的细胞器,通过不断的融合分裂形成网状结构,来维持其正常功能与形态,并参与细胞的能量代谢、自噬与凋亡等,这种动态的变化称为线粒体分裂融合(mitochondrial fission and fusion),也称为线粒体动力学(mitochondrialdynamics)。探讨脑神经细胞线粒体动力学与脑缺血疾病的相关性,及中药对其的保护作用机制,对于防治脑缺血疾病具有一定的意义。 目的: 探讨缺血缺氧损伤对神经元线粒体动力学的影响,初步明确中药复方赛络通胶囊(SLT)与其有效成分对神经细胞线粒体功能的影响,探讨其对线粒体保护作用的机制。本研究在局灶性脑缺血再灌注大鼠、SH-SY5Y细胞缺氧复氧损伤两个水平进行了研究,旨在阐明缺血缺氧损伤对脑神经细胞线粒体分裂、融合的影响及中药对脑神经细胞线粒体保护作用机制的研究。 方法: 第一部分 SLT对局灶型脑缺血/再灌注大鼠脑神经细胞线粒体动力学的影响 本部分实验采用大鼠90min中脑动脉闭塞(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)再灌注模型,通过神经行为评分、透射电镜观察线粒体超微结构、HE染色观察病理学形态初步评价SLT对皮层区缺血再灌注(hypoxiareoxygenation,I/R)损伤的保护作用;在此基础上,通过免疫组织化学法检测Drp1、Opa1表达,蛋白免疫印迹法检测线粒体分裂融合基因Drp1、Opa1表达,考察脑缺血损伤后线粒体动力学的改变及SLT对I/R损伤皮层区线粒体动力学的影响。 第二部分 SLT主要有效成分抗SH-SY5Y细胞缺氧复氧损伤机制研究 依据前期对SLT体内药代动力学和药动学/药效学数据分析研究结果,本部分实验选择SLT主要活性成分西红花苷、银杏内酯进行细胞水平的研究。首先建立人神经母细胞瘤细胞——SH-SY5Y细胞培养体系,通过MTT法考察西红花苷、银杏内酯对正常培养SH-SY5Y细胞活力的影响;在此基础上,依据前期基础及参考文献建立SH-SY5Y细缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)损伤模型,采用流式细胞仪器分析SH-SY5Y细胞胞内钙离子浓度及线粒体膜电位的改变,免疫荧光法检测Drp1、Opa1在胞内的表达变化,蛋白免疫印迹法检测线粒体分裂融合基因Drp1、Opa1、Mfn1、Mfn2表达,考察细胞H/R损伤后线粒体动力学的改变及SLT有效成分对其的影响。 结果: 在第一部分实验中,我们观察到如下结果:(1)与模型组相比,SLT高、中剂量均可显著降低缺血再灌注大鼠神经行为评分的分值,人参提取物、银杏叶提取物及西红花提取物亦能降低缺血再灌注大鼠神经行为评分的分值,但较SLT高剂量组分值略高;(2) SLT高剂量可有效减轻I/R引起的脑神经细胞线粒体形态破坏,减轻神经元水肿损伤,线粒体内外膜机构较完整,线粒体肿胀及空泡状改变减轻;线粒体嵴的数目和形态趋于正常;(3) SLT高剂量组较模型组病变减轻,皮层神经元少量变性,核固缩和核溶解程度减轻,神经元的凋亡与坏死受到抑制,较为明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠皮层缺血周边半暗带区神经元及突触超微结构损伤;(4) SLT可抑制缺血侧皮层区线粒体分裂融合异常,抑制线粒体分裂基因Drp1表达,促进线粒体融合基因Opa1表达,最终减轻缺血再灌注带来的能量代谢紊乱,而各个提取物也能在一定程度上改变二者蛋白表达,但SLT组更为明显。 在第二部分试验中,我们发现:(1)与模型相比,西红花苷可显著降低H/R损伤的SH-SY5Y细胞内的ADP/ATP比率,从而提高细胞代谢速率;(2) H/R损伤后细胞线粒体膜电位降低,胞内钙离子浓度升高,西红花苷与银杏内酯可显著恢复线粒体膜电位,降低胞内钙离子浓度;(3)与正常组比较,H/R损伤的SH-SY5Y细胞线粒体动力学相关蛋白表达异常,Drp1表达量升高,Opa1、Mfn1表达量降低,线粒体分裂融合异常,西红花苷与银杏内酯能在一定范围内下调Drp1表达,上调Opa1表达,从而抑制线粒体分裂融合异常。 结论: 综上所述,我们得出以下结论,(1)缺血缺氧损伤后,神经元内能量代谢异常,线粒体分裂融合异常,线粒体动力学失常导致神经元死亡;(2) SLT及其有效成分可能以线粒体动力学为靶点,恢复神经细胞线粒体正常动态变化从而恢复正常的能量代谢,以达到治疗目的。