研究背景近年来,我国2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）已经成为严重的公共健康问题之一。胰岛β细胞功能的减退是T2DM发病的重要机制之一,据英国糖尿病前瞻研究指出,糖尿病患者的胰岛功能在确诊时就已经衰减50%。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,Hu-MSCs）已被多项临床研究证实可以分泌多种生长调节因子改善残存的胰岛β细胞功能从而改善T2DM患者的血糖控制情况。然而,Hu-MSCs用于临床治疗时,所需的数量较大,为了获得足量临床移植用的Hu-MSCs,需要体外扩增培养。细胞在体内外生长过程中具有有限的分裂次数,称为Hayflick极限,当分裂次数达到Hayflick极限时,干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）细胞形态改变,由梭形变为扁平,其衰老相关标志物β-半乳糖苷酶活性升高,细胞增殖受到抑制。衰老会影响干细胞的分化潜能、迁移、归巢及免疫调节的能力。随后,衰老的细胞会启动细胞凋亡。MSCs在体外扩增培养过程中同样不可避免地发生复制性衰老,从而导致MSCs增殖减慢、功能障碍,最后停止增殖,该问题严重制约了 MSCs在临床的应用。因此,如何使恢复衰老MSCs的功能,更充分的利用其价值成为再生医学的热门研究。传统的研究发现,干细胞的衰老的主要因素有DNA损伤和线粒体功能障碍等。随着越来越多的人开始研究MSCs衰老,其衰老相关机制的研究逐渐深入到分子水平,如衰老相关转录因子、Sirtuin家族等。近年来,越来越多的学者尝试了多种生物学方法延缓MSCs的衰老:SIRT5抑制可增强MSCs体外培养扩增过程中的增殖,并增强其对缺血性疾病的治疗能力;用褪黑素预处理衰老MSCs后,其抑制细胞凋亡和促进血管新生的能力得到提高,进而促进缺血下肢的功能恢复。然而,对于延缓MSCs衰老是否能改善其对糖尿病的治疗能力,目前尚未见相关文献研究报道。环磷酸鸟苷—腺苷合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）—干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon gene,STING）信号通路于2012年首次报道,随后越来越多的研究证实其在免疫、肿瘤、代谢等生物学功能中发挥着重要的作用。cGAS-STING信号通路是胞浆双链DNA（dsDNA）传感器,是先天免疫对感染、炎症和癌症做出生理性反应。最近的研究显示,cGAS-STING参与了细胞衰老的发生发展过程。文献报道,MSCs衰老过程中SIRT7表达下降,SIRT7敲除后,MSCs异染色质区域的基因组变得更加开放,诱导MSCs加速衰老,而STING敲除可逆转SIRT7缺失造成的衰老表型,使MSCs恢复增殖能力。但是MSCs在体外扩增衰老过程中STING及其下游分子如何改变,目前仍不明确。综上所述,我们针对目前MSCs体外扩增产生的衰老问题,拟从分子、细胞、动物多方面观察STING对Hu-MSCs衰老的作用,探讨抑制STING能否改善衰老Hu-MSCs对2型糖尿病的治疗作用,以期为Hu-MSCs在糖尿病及其他疾病的应用中提供新的思路。研究目的探究STING-IRF3信号通路与Hu-MSCs衰老之间的关系,以及抑制STING能否改善衰老Hu-MSCs对2型糖尿病的治疗作用。研究方法1Hu-MSCs的分离鉴定:华通胶剪碎后铺于细胞培养瓶中,加入Hu-MSCs的完全培养基,每隔三天半量换液。此时所得到的为P0代Hu-MSCs。取P3代Hu-MSCs进行诱导,观察其分化情况。用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD34、CD73、CD105、HLA-DR的表达情况,以确定所得细胞是否为Hu-MSCs。2体外扩增多代Hu-MSCs的复制性衰老情况评估。在体外连续扩增培养,得到传代后期（P8代）Hu-MSCs,以P3代细胞作为对照。β-半乳糖苷酶检测P3、P8代Hu-MSCs的衰老情况;提取细胞蛋白,Western blot检测其衰老相关蛋白P16、P21的表达情况;qPCR技术检测P16、P21 mRNA水平的变化。分别用细胞计数实验和划痕实验反映Hu-MSCs的增殖能力和迁移能力,qPCR技术和Western blot检测衰老Hu-MSCs的IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子指标的表达情况。3衰老Hu-MSCs对PA诱导的Min6细胞凋亡的影响。分别将P3和P8代Hu-MSCs与PA刺激的Min6细胞共培养,对Min6细胞的凋亡情况进行评估,以确定衰老Hu-MSCs对Min6细胞的保护作用是否减弱。Western blot检测Min6细胞凋亡相关指标（Bax/Bcl-2、cleaved Caspase3/Caspase3、cleaved PARP/PARP）的表达情况,TUNEL 染色观察 Min6细胞凋亡情况。4衰老Hu-MSCs的STING-IRF3信号通路活化情况。免疫荧光检测P3、P8代Hu-MSCs的STING蛋白及其下游p-IRF3的表达情况,Western blot检测P3、P8代Hu-MSCs 的 STING、p-IRF3、IFN-β的变化。5抑制STING-IRF3信号通路后衰老Hu-MSCs的情况评估。利用STING小干扰敲低P8代Hu-MSCs的STING分子,观察抑制STING-IRF3信号通路后P8代Hu-MSCs的衰老情况、细胞炎症因子表达、以及增殖和迁移能力是否改善。细胞衰老情况用β-半乳糖苷酶染色实验检测,细胞计数实验和划痕实验检测Hu-MSCs的增殖能力和迁移能力,Western blot 检测衰老 Hu-MSCs 的 STING-IRF3 信号通路蛋白（STING、p-IRF3、IFN-β）是否被抑制以及检测衰老相关蛋白（P16、P21）和炎症因子指标（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达情况。6抑制STING-IRF3信号通路后衰老Hu-MSCs对PA诱导的min6细胞凋亡影响。分别将P3代、P8代和P8敲低STING后的Hu-MSCs与PA刺激后的Min6细胞共培养,观察Min6细胞的凋亡情况,以确定敲低STING后的衰老Hu-MSCs对Min6细胞的保护作用是否增强。Western blot检测Min6细胞凋亡相关指标（Bax/Bcl-2、cleaved Caspase3/Caspase3、cleaved PARP/PARP）的表达情况,TUNEL 染色观察 Min6 细胞凋亡情况。7高脂饮食两个月后注射STZ建造T2DM小鼠模型,随机分组,经尾静脉分别输注PBS、P3代、P8代和P8敲低STING后的Hu-MSCs,正常饮食组小鼠输注PBS作为对照,小鼠的体重和血糖需要每周监测。最后一周进行腹腔胰岛素耐量实验（IPITT）和腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）,利用双能X线检测小鼠体脂成分。用心尖取血法取血,检测血脂（TG、TC）,留取小鼠的胰腺、肝脏、内脏脂肪和皮下脂肪的组织备用。研究结果1我们所分离提取的细胞为Hu-MSCs。提取的人脐带华通胶组织块培养5-7天后周围爬出细小梭形的细胞,呈平行或漩涡状排列。取P3代 Hu-MSCs进行定向诱导,结果为:成骨诱导21天后茜素红染色,可观察到橘红色的钙结节;成脂诱导14天后油红O染色,镜下可观察到大量红色脂滴;流式细胞仪鉴定细胞表面标志物,其中CD105和CD73表达阳性,CD34和HLA-DR表达阴性。2 Hu-MSCs在体外扩增培养过程中存在复制性衰老。我们将分离培养的Hu-MSCs在体外扩增培养至P8代,检测其衰老情况:β-半乳糖苷酶染色结果显示与P3代相比,P8代Hu-MSCs中阳性细胞数增多。Western blot以及qPCR检测P3代和P8代Hu-MSCs的衰老相关蛋白指标（P16,P21）,结果显示P8代Hu-MSCs的衰老相关蛋白指标明显上调。细胞计数实验和划痕实验结果显示与P3代相比,P8代Hu-MSCs的增殖能力和迁移能力都显著下降。衰老Hu-MSCs的细胞炎症指标（IL-1β,IL-6,TNF-α）检测结果显示衰老的Hu-MSCs存在着炎症指标的上调。3衰老Hu-MSCs抑制PA诱导Min6细胞凋亡的能力下降。分别将P3代和P8代的Hu-MSCs与PA刺激后的Min6细胞共培养24小时,检测Min6细胞的凋亡指标。Western blot 检测凋亡指标（Bax/Bcl-2,cleaved Caspase3/Caspase3,cleaved PARP/PARP）结果显示与P8代Hu-MSCs共培养的Min6细胞的凋亡指标上调。TUNEL染色也显示与P8代Hu-MSCs共培养的Min6细胞组凋亡阳性染色细胞增加。4衰老Hu-MSCs存在STING-IRF3信号通路的激活。细胞爬片免疫荧光显示STING及其下游磷酸化的IRF3都在P8的Hu-MSCs内有上调的趋势,尤其磷酸化的IRF3现象更加明显。Western blot检测STING及其下游的蛋白,结果显示在P8代Hu-MSCs中,STING及其下游的蛋白（p-IRF3/IRF3,IFN-β）表达量明显上调。5抑制衰老Hu-MSCs的STING-IRF3通路后其衰老指标下调,细胞炎症反应减弱,增殖能力、迁移能力上调。转染STING小干扰后的P8代Hu-MSCs（P8 siRNA）的STING及其下游分子均被抑制。β-半乳糖苷酶染色实验结果显示与P8代相比,P8 siRNA代Hu-MSCs中阳性细胞数减少,Western blot检测P8代和P8 siRNA代Hu-MSCs的衰老相关蛋白指标（P16,P21）,结果显示P8 siRNA代Hu-MSCs的衰老相关蛋白指标明显下降。细胞计数实验和划痕实验结果显示与P8代Hu-MSCs相比,P8 siRNA代Hu-MSCs的增殖能力和迁移能力都得到改善。细胞炎症指标（IL-1β,IL-6,TNF-α）的检测结果显示P8 siRNA代Hu-MSCs的炎症指标下调。6抑制衰老Hu-MSCs STING-IRF3信号通路后其对β细胞的抗凋亡能力增加。Western blot 检测凋亡指标（Bax/Bcl-2,cleaved Caspase3/Caspase3,cleaved PARP/PARP）结果显示与P8代Hu-MSCs相比,P8 siRNA代Hu-MSCs共培养的Min6细胞的凋亡指标下调。同时TUNEL染色也显示与P8 siRNA代Hu-MSCs共培养的Min6细胞组凋亡阳性染色细胞减少。7抑制衰老Hu-MSCs的STING-IRF3信号通路可以更好的降低T2DM小鼠的血糖。T2DM组小鼠与对照组相比体重有明显的上升,经过Hu-MSCs的干预后,T2DM小鼠的体重有所下降,其中P8代Hu-MSCs干预组的减重效果要弱于P3代Hu-MSCs干预组,但P8 siRNA代Hu-MSCs干预组降低体重的效果要好于P8代Hu-MSCs干预组。T2DM小鼠呈肥胖体型,体脂含量较正常小鼠相比明显升高,而经过Hu-MSCs的干预后,T2DM小鼠的体脂有所下降,其中P8代Hu-MSCs干预组的干预效果要弱于P3代Hu-MSCs干预组,但P8 siRNA代Hu-MSCs干预组的干预效果要好于P8代Hu-MSCs干预组。我们又进一步检测了小鼠的血清学指标,结果显示经过Hu-MSCs的干预后,T2DM小鼠的血清TG、TC有所下降,其中P8代Hu-MSCs干预组的干预效果要弱于P3代Hu-MSCs干预组,但P8 siRNA代Hu-MSCs干预组的干预效果要比P8代Hu-MSCs干预组强。IPITT和IPGTT实验提示P8STING-/-代Hu-MSCs干预后改善T2DM小鼠受损的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量的能力要比P8代Hu-MSCs好,但还是弱于P3代Hu-MSCs干预组。研究结论体外扩增培养的Hu-MSCs存在复制性衰老,而STING参与这一衰老进程。在体内和体外实验中,衰老的Hu-MSCs对胰岛β细胞的保护作用减弱,抑制STING-IRF3信号通路能延缓体外培养的Hu-MSCs的衰老并改善Hu-MSCs对胰岛β细胞的保护作用。