研究背景：Graves病(GD)是由甲状腺受体抗体(TRAb)所介导的一种自身免疫性疾病,临床表现为甲状腺机能亢进和弥漫性甲状腺肿大。GD甲状腺肿与其愈后密切相关,许多研究证实合并甲状腺肿大的GD患者比不合并甲状腺肿的患者在接受药物和I131治疗后,缓解率明显降低,复发率明显升高。研究表明GD患者甲状腺中抗凋亡蛋白BCL-2、FLIP等明显升高,而促凋亡蛋白FAS, FASL, Bax明显降低。说明在GD甲状腺中细胞增殖增加而细胞凋亡减少。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1IGF-1)在GD甲状腺肿形成过程中起了重要作用。IGF-1是甲状腺细胞的生长必不可少的生长因子。研究发现在GD患者增生的甲状腺组织中IGF-1与IGF-1受体的表达同时升高；并且IGF-1与GD甲状腺肿的形成密切相关。我们的前期研究也证实：血浆IGF-1水平与GD患者甲状腺肿大的程度呈正相关。高水平的IGF-1一方面通过上调cyclin D促进甲状腺细胞从G0/G1期进入S期,导致甲状腺细胞增殖；另一方面通过PI3K细胞通路促进FLIP的表达,抑制甲状腺细胞的凋亡。传统GD治疗方法包括：抗甲状腺药物、I131和手术治疗。这三种治疗方法临床缓解率偏低,均有不同程度的复发,并且存在白细胞减低、肝功能损伤、甲状腺功能减退、喉返神经损伤等副作用。所以研究GD甲状腺肿的发病机理,并且探讨针对GD甲状腺肿治疗方法具有重要意义。薯蓣皂苷元是一种甾体皂苷,广泛存在于各种植物中比如：穿山龙、山药、葫芦巴种子等,在制药工业中作为原材料用于生产多种甾体类激素。薯蓣皂苷元的多种生物学活性通过体内或体外实验得到证实：薯蓣皂苷元通过促进胆道和肠道胆固醇的排泄降低血浆胆固醇水平；在卵巢切除的成年大鼠模型中可以模拟雌激素样作用。薯蓣皂苷元在多种肿瘤细胞株中,通过多途径发挥抗增殖促凋亡作用。例如：在人类HCT-116结肠癌细胞中薯蓣皂苷元通过降低HMG-CoA还原酶水平促进HCT-116凋亡；在人K562白血病细胞中通过调节Ca离子稳态和线粒体凋亡因子水平,促进K562细胞凋亡；在HER2过表达的人乳腺癌细胞中通过抑制脂肪酸合成酶的表达,调节Akt、mTOR和JNK蛋白的磷酸化,发挥促凋亡作用。薯蓣皂苷元的促凋亡作用不仅可以用于肿瘤细胞,而且可以用于增殖的正常细胞。例如：薯蓣皂苷元通过上调环氧化酶-2(COX-2),产生过量的前列腺素E2(PGE-2),促进人风湿性关节炎滑膜细胞凋亡。国内外文献检索未见薯蓣皂苷元治疗甲状腺疾病的报道。细胞凋亡是一种程序死亡过程,通常由内源性和外源性两条信号通路诱导发生。在外源性信号通路中,死亡配体与受体结合,传导死亡信号,并形成死亡诱导信号复合物(DISC):包括死亡结构域(FADD)和其下游分子caspase8。DISC招募多个caspase8,并且通过自身降解激活caspase8,顺序激活下游的凋亡执行蛋白。FLIP竞争性地与FADD结合,阻止DISC形成,抑制caspase8的自身激活,发挥抗凋亡作用。在内源性信号通路中,促凋亡因子改变了线粒体膜电位(MMP)的通透性,细胞色素C由线粒体释放到胞浆中,与凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)和ATP相结合,然后结合caspase9形成凋亡体,凋亡体通过自身降解激活caspase9。激活的caspase8和caspase9顺序性地激活死亡执行器caspase3,导致细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括：Bax、Bcl-2等,通过影响线粒体膜电位改变,调节内源性细胞凋亡。由以上研究可知甲状腺细胞增殖和凋亡之间的关系失衡是导致GD甲状腺肿大的重要因素,甲状腺细胞的增殖与IGF-1呈正相关。所以本研究将观察薯蓣皂苷元诱导IGF-1刺激下的人原代甲状腺细胞凋亡的分子机制。研究结果显示薯蓣皂苷元可以明显诱导IGF-1刺激下的人甲状腺原代细胞凋亡,其主要机制是通过激活caspase信号通路,其中外源性通路是通过抑制FLIP的表达激活caspase8;内源性通路是通过增加活性氧(ROS)产生、调节Bax,Bcl-2之间的平衡,激活caspase9实现的。这些研究表明薯蓣皂苷元是一种有前途的治疗GD甲状腺肿的药物。研究目的：1.通过MTT、细胞荧光染色、流式细胞技术观察薯蓣皂苷元对IGF-1刺激下的甲状腺原代细胞的促凋亡作用。2.通过免疫印迹技术证明薯蓣皂苷元的促凋亡作用是通过激活内源性和外源性caspase信号通路实现的。研究方法：1.人原代甲状腺细胞培养正常甲状腺组织来自山东省立医院甲状腺次全切手术中切除的结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤的远端组织,每个标本经病理专家鉴定为正常甲状腺组织。新鲜的甲状腺组织被切成1×1cm。大小,经D-Hanks’液反复冲洗后,在含有0.25%胶原酶Ⅰ(Sigma)和0.125%胰酶(Sigma)的消化液中,恒温(37℃)水浴震荡消化40-60分钟。消化液经200目滤网过滤去除胶原组织、并离心得到甲状腺细胞。甲状腺细胞培养于DMEM/F12K(1：1)培养基,含有10%新生牛血清,2mU/mL的TSH,和青链霉素双抗。细胞培养条件5%C02,37℃孵箱。2.细胞处理和实验分组甲状腺原代细胞经过3-5天生长,当细胞融合至70-80%,改为饥饿培养基(DMEM/F12K(1：1)含有0.2%新生牛血清,无TSH)饥饿24小时,然后用或者不用含有IGF-1(100ng/ml, sigma)的饥饿培养基预处理24小时后,加入不同浓度的薯蓣皂苷元作用相应的时间。3.实验方法(1)应用MTT法检测细胞增殖活性,Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞分析磷脂酰丝氨酸外翻检测细胞凋亡的发生。(2)蛋白印迹法检测细胞信号通路蛋白的表达。(3)流式细胞技术检测细胞内活性氧(ROS)产生。研究结果：1.薯蓣皂苷元抑制IGF-1诱导的甲状腺细胞增殖100ng/ml的IGF-1能显著地促进人原代甲状腺细胞增殖,促增殖作用1.6倍于无IGF-1作用组(p<0.05)。薯蓣皂苷元能明显抑制IGF-1诱导的甲状腺细胞增殖并且这种抑制作用呈现剂量和时间的依赖关系(p<0.05)。2.薯蓣皂苷元诱导IGF—1作用下的甲状腺细胞凋亡的细胞形态学的改变Hoechst33342/PI荧光染色显示：正常的甲状腺细胞核形态正常,被Hoechst33342轻度蓝染,很少部分凋亡细胞呈核浓集。IGF-1作用下的甲状腺细胞数目较正常对照组增多,并且呈现更少的核浓集细胞。20μ mol/1薯蓣皂苷元作用下的细胞,部分细胞呈现凋亡的形态学改变：细胞皱缩,核浓集。早期凋亡的细胞被Hoechst33342深度蓝染,晚期凋亡细胞被Hoechst33342和PI双染。40μ mol/1薯蓣皂苷元作用的甲状腺细胞,凋亡的甲状腺细胞明显增多,而且呈现PI单染的坏死的细胞。说明薯蓣皂苷元诱导细胞凋亡具有量效相关性。3.薯蓣皂苷元提高了IGF-1作用下的甲状腺细胞的凋亡比率流式细胞仪检测annexin V/PI染色显示：单IGF-1作用组总的凋亡细胞数为6.70%,明显低于无IGF-1作用的正常对照组7.53%(p<0.05)。20μ mol/1薯蓣皂苷元作用组,凋亡细胞比率升高至27.83%,明显高于单IGF-1作用组(p<0.05)。40μ mol/1薯蓣皂苷元作用组显示凋亡细胞比率为34.41%,明显高于20μ mol/1薯蓣皂苷元作用组(p<0.05),说明薯蓣皂苷元的促凋亡作用呈量效关系。4.薯蓣皂苷元诱导IGF-1作用下的甲状腺细胞凋亡通过激活caspase级联免疫印迹法显示：正常甲状腺细胞表达全长的caspase3, caspase8, caspase9蛋白,并且微弱表达它们各自的终末活性片段。IGF-1作用后与正常组相比,caspase3, caspase8, caspase9蛋白的终末活性片段表达量减少,说明IGF-1抑制·caspase3, caspase8, caspase9蛋白激活。薯蓣皂苷元处理组显示：caspase3, caspase8, caspase9蛋白被完全裂解为它们的终末活性片段,呈量效关系。说明薯蓣皂苷元激活了caspase级联。5.薯蓣皂苷元通过P13K信号通路下调FLIP蛋白表达并激活caspase8为了阐明P13K细胞通路在薯蓣皂苷元促凋亡机制中的作用,我们应用P13K特异性阻断剂LY294002预处理甲状腺细胞1小时,然后用含有IGF-1(100ng/ml,s i gma)的培养基处理24小时,最后加入40μ mol/1的薯蓣皂苷元作用48小时。FLIP, caspase8蛋白水平通过免疫印迹法检测。我们发现IGF-1上调了FLIP的表达,并且抑制caspase8的激活。单用40μ mol/1的薯蓣皂苷元作用48小时后,IGF-1上调了FLIP的作用被明显抑制了,而caspase8被激活。薯蓣皂苷元下调FLIP和激活caspase8的程度与P13K阻断剂LY294002相似。LY294002预处理甲状腺细胞1小时,薯蓣皂苷元的上述作用被明显增强。6.薯蓣皂苷元重新调节Bcl-2,Bax之间的平衡关系,并激活Caspase9Caspase9,Bcl-2,Bax蛋白表达通过免疫印迹法进行测量。研究结果显示与正常甲状腺细胞相比IGF-1抑制Caspase9的自身激活,减少Caspase9活性终末片段的表达。而薯蓣皂苷元则激活了Caspase9使其裂解为最终的活性亚基(P17)。Bcl-2和Bax是线粒体凋亡通路的一对作用相反的调控因子。IGF-1预处理显示,抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,促凋亡蛋白Bax表达下调。相反的,40μm01/1的薯蓣皂苷元作用48小时后,与IGF-1预处理组相比,Bcl-2表达明显降低,而Bax表达明显升高。7.薯蓣皂苷元激活氧化应激流式细胞测定细胞内活性氧含量显示：与正常组相比IGF-1明显减少活性氧产生,薯蓣皂苷元能明显增加细胞内活性氧的含量。由此可见,薯蓣皂苷元可能通过产生过多的活性氧激活了线粒体凋亡通路。研究结论：1.薯蓣皂苷元诱导IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞凋亡。2.薯蓣皂苷元激活凋亡执行蛋白caspase3。3.薯蓣皂苷元通过P13K通路阻断FLIP,激活caspase8。4.薯蓣皂苷元重新调节Bcl-2,Bax之间的平衡关系,并激活Caspase9。5.薯蓣皂苷元通过产生ROS激活线粒体信号通路。