毕赤酵母异源表达仁果褐腐病菌漆酶及酶学特性与功能的研究

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仁果褐腐病菌(Monilinia fructigena)是引起果树褐腐病的三大病原菌之一,可导致仁果类果树发生果腐、花腐和叶枯,在运输、贮藏期间也易发生,造成严重的损失。目前关于仁果褐腐病菌的致病性研究主要集中在环境因子与病害相关性探索,对该病菌自身的生活史、致病机理等研究较少。研究发现:漆酶在很多真菌病害病原菌的致病过程中充当重要的毒力因子。漆酶不仅与真菌的出芽、木质素降解有关,同时还可以保护病原菌免受植物中产生的抗毒素和单宁酸的影响。M. fructigena称仁果丛梗孢,属半知菌亚门真菌。病菌侵染后,果实初生褐色圆形病斑,后迅速扩展至全果,致果肉烂腐。从病害症状推测病原菌中的漆酶可能与致病过程有很大的关系。鉴于目前缺乏相关的研究报道,本研究通过酵母分泌表达仁果褐腐病菌漆酶,研究该漆酶的酶学性质与功能,为后续探讨漆酶在仁果褐腐菌致病过程中所起的作用提供基础依据。本文根据NCBI数据库公布的仁果褐腐病菌漆酶氨基酸序列,进行了毕赤酵母的偏爱密码子和结构优化,通过PTDS方法合成了适合于甲醇诱导型毕赤酵母表达的仁果褐腐病菌漆酶((MfLCC2I)基因,将含有目的基因甲醇酵母表达载体pMY8025,电击转化入毕赤酵母GS115菌株后,通过活性鉴定、SDS-PAGE鉴定等方法,获得了仁果褐腐病菌漆酶表达的阳性酵母菌株。将获得的毕赤酵母工程菌株进行扩大表达及诱导,获得重组漆酶,研究了该漆酶的酶学特性和动力学常数等,同时研究了漆酶对典型的多酚化合物2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)的降解效果。结果表明:该重组酶的最佳pH为3.6,最佳温度为45℃,在50℃以下具有很高稳定性,在酸性缓冲液中稳定性较高;对底物ABTS和愈创木酚的米氏常数Km分别为0.0012和0.0016mM, Vmax分别为243.9和10.55U*min-1*mg-1; Cu2+、Ca2+、Cr3+和甘氨酸等对该重组酶活性具有强烈的促进作用,相反Mn2+、Fe3+和NaN3等对该重组酶活性具有强烈的抑制作用;在最佳反应条件下,使用该重组酶处理2,4,6-TCP8h后,可以达到80%的降解率。关于仁果褐腐病菌漆酶的酶学性质及功能研究不仅为阐述漆酶在M.fructigena发育进程及致病机理中所起的作用提供理论依据,并且为仁果褐腐病菌漆酶高效工程菌株的构建、工业化生产和污染治理等方面提供了一定的基础。
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