目的肺癌是一种死亡率、发病率极高的恶性肿瘤。近年来许多国家对于肺癌的控制以及治疗投入了巨大的财力物力,但是其发病率及死亡率仍然在不断上升。2008年11月第八个“全球肺癌关注月”,世界卫生组织年鉴表明:近几年,肺癌以欧美国家高发,在据统计的50个国家和地区中,肺癌居恶性肿瘤首位的有36个国家和地区。而肺癌已成为中国的第一大癌,卫生部公布的《2006年城乡居民主要死亡原因》显示,我国肺癌的调整发病率已高达61.4/10万,更令人忧虑的是,肺癌发病率仍呈现着不断攀升的趋势,2015年,我国将成为世界第一肺癌大国。肺癌在病理学上可分为鳞癌、腺癌、大细胞肺癌和小细胞肺癌;按类型分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。小细胞肺癌占全部的肺癌的12%～15%,小细胞肺癌是一种恶性程度很高的肿瘤,生长迅速,容易早期全身转移,而且小细胞肺癌是所有治疗敏感的肿瘤中最难治愈的一种。当今社会生活中健康已成为人类的第一需求。人类为征服癌症不断地进行着努力。随着社会的发展和科技的进步,人类对机体的生长发育、遗传与进化、免疫防御、衰老死亡等生命现象的认识有了突破性的进展,而且人类在病毒与肿瘤、细胞分化与肿瘤、细胞周期与肿瘤、癌基因、抑癌基因、信号传导与肿瘤和新生血管形成与肿瘤转移等方面也取得进展。目前,普遍认为不可控制的细胞增生是恶性肿瘤的主要特征。肿瘤的恶性增生从生物学角度看主要表现在两个方面:一方面是肿瘤细胞的不灭性即凋亡障碍;另一方面是细胞分裂的失控即细胞周期网络调控系统的障碍,这两方面都是目前分子肿瘤学研究的热点。凋亡障碍常有癌基因和蛋白的参与。bc1-2（B-cell lymphoma-2）基因发现于t（14;18）染色体易位的B细胞淋巴瘤,与其他癌基因不同,bc1-2的作用是抑制细胞的凋亡而不是促进细胞的增殖。Bc1-2蛋白通过抑制促凋亡蛋白Bax和Bak的活性,抑制细胞凋亡。因凋亡作用的减弱不能及时清除细胞周期紊乱和具有突变倾向的细胞,故抗凋亡蛋白的过度表达与肿瘤的发生密切相关。研究显示,多种肿瘤细胞中有Bc1-2蛋白的表达增加。细胞周期调控异常不仅是肿瘤发生的重要前提,而且也是促进肿瘤恶性增殖和转移的重要因素。细胞周期有两个重要的转换点即G1/S和G2/M。在它们的转换中都设有设有存在检查点。控制这些检查点即可以实现对细胞周期的调控。有一些学者认为肿瘤发生的最根本的原因是这两个检查点的失控使得原本应该停止增生的细胞或生理凋亡的细胞不停的进入细胞周期因而导致细胞的恶性增生。肿瘤的发生是正常染色体多重损伤的复杂过程,其最终表现为细胞周期调控机制的紊乱,分化受阻细胞表现为无限制自主的增生和分裂。细胞周期调控异常主要表现为细胞周期时相的变化和相关调控因子——细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）及其抑制剂（CKIs）的表达异常。CyclinE属于细胞周期G1期的正性调节因子,主要参与细胞周期G1/S期转换的调控,并与其他调控因子cyclinD、视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）、转录因子E2F、抑癌基因表达产物p53、Kip家族、CDK2、4、6等相互作用决定细胞的生存与凋亡。cyclinE在细胞周期的G1晚期和S期表达,且在G1/S期达到峰值。CyclinE蛋白的过早及过高表达可加速细胞进入S期,促进细胞的增殖。CyclinE-CDK2复合物的作用被认为是启动DNA复制及进入S期的重要调节因素,而其作用与细胞中的cyclinE的表达水平及CDK2的激酶活性密切相关。G1期的缩短,减少了细胞对生长因子的依赖性,从而有利于肿瘤的发生。在一些研究报道中,大多数肿瘤包括肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌及胰腺癌中都有cyclinE的过度表达,并且在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌中,cyclinE还被认为与肿瘤发生密切相关,并作为预示肿瘤发展的一项独立指标。此外,cyclinE与肿瘤血管的生成和肿瘤的转移关系密切。有研究表明CyclinE可能是通过以下两种可能的机制参与转移:其一是cyclinE-CDK2复合物的靶蛋白参与细胞黏附的丢失,其表现为有丝分裂相关的细胞迁移性增加;其二,最新的研究证据表明,cyclinE基因的过度表达影响了染色体的稳定性。高水平表达的cyclinE蛋白影响S期进程,可产生非整倍体细胞。在肾癌、胰腺癌、B-细胞淋巴瘤等肿瘤的研究中,已发生转移病例的cyclinE蛋白的表达明显高于未发生转移的病例,并与肿瘤的病理、临床分级相吻合,直接影响患者的预后。目前在有关肺癌的研究中,对于Bc1-2蛋白的研究多集中于鳞癌、腺癌,小细胞肺癌及小细胞肺癌细胞系的研究报道相对较少。有关CyclinE蛋白的研究多以消化道肿瘤和妇科肿瘤为主,但CyclinE蛋白与肺癌发生和发展关系的研究少见。因此,本研究以大细胞和小细胞肺癌细胞系做为研究对象,主要检测Bc1-2蛋白和CyclinE蛋白在肺癌细胞中的表达变化,并探讨其在肺癌发生和发展中的作用及其与生物学行为之间的关系。方法1.细胞培养,MRC-5细胞在含10%小牛血清的MEM培养液、H460和H446细胞在含10%小牛血清的RPMI1640培养液、在饱和湿度、在37℃、5%CO₂孵箱中传代培养。2.应用Western-blot法检测Bc1-2蛋白在MRC-5、H460和H446三种细胞内的表达差异。3.以H460细胞系为标准,通过噻唑蓝（MTT）比色实验检测细胞的生长和增殖情况,并绘制生长曲线,筛选UV照射细胞的剂量和后续培养时间。4.应用免疫组化法检测MRC-5、H460和H446三种细胞在UV照射后不同培养时间下Bc1-2蛋白的表达差异。5.应用双重胸腺嘧啶核苷（TdR）对细胞进行同步化处理。6.应用流式细胞术检测胸腺嘧啶核苷（TdR）诱导细胞同步化的效果。7.应用Western-blot法检测同步化后MRC-5、H460和H446三种细胞内CyclinE蛋白的表达差异。结果1.Western_blot法检测Bc1-2蛋白的表达Bc1-2蛋白在MRC-5、H460和H446三种细胞中的表达有明显差别（P<0.01）,测得肺肿瘤细胞系H460和H446的Bc1-2蛋白表达灰度值分别为MRC-5的6.10倍和4.60倍。2.筛选UV照射的时间和剂量（1）培养时间固定,UV照射剂量分别为20s、40s、60s和80s时,随着照射剂量的增大,细胞的增殖明显下降,并且80s照射剂量的细胞死亡较多。说明UV照射对细胞的增殖抑制有剂量依赖性,但较大剂量可致细胞死亡。（2）当UV照射剂量固定（60s）,进一步细化后续培养时间,发现在10.5小时时细胞增殖达最大抑制。3.免疫组化法检测UV照射后细胞中Bc1-2蛋白的表达UV照射后,MRC-5、H460和H446三种细胞系中Bc1-2蛋白的表达水平均较未经UV照射的细胞有明显升高。随着照射后培养时间的延长,阳性细胞的比例增加并且阳性细胞的颜色加深,尤其是在培养10.5h后,那些已与周围失去粘连作用的细胞均呈深棕色,提示Bc1-2蛋白的表达与照射后的培养时间正相关。4.流式细胞术检测细胞同步化结果胸腺嘧啶核苷诱导的细胞经流式细胞仪检测的结果显示,各组细胞80%以上处于G1期,10%左右处于S期,仅有一小部分细胞处于G2和M期,表明各组细胞已经同步化于G1/S期。5.蛋白印迹检测结果MRC-5、H460和H446三种细胞中CyclinE蛋白的表达水平有明显差别（P<0.01）,肺肿瘤细胞系H460和H446CyclinE蛋白表达的灰度值分别是肺正常细胞MRC-5的10.59倍和5.72倍。结论1.Bc1-2蛋白的过表达与肺癌的发生有关。2.经UV照射肿瘤细胞保留了其正常的应激能力,这可能与肿瘤细胞的永生性具有一定的相关性。3.CyclinE蛋白的过表达与肺癌的发生具有一定关系。4.CyclinE蛋白与肺癌的转移可能相关。