乳蛋白营养丰富,其中的酪蛋白含量为76%～86%,酪蛋白包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。酪蛋白作为一种重要的营养物质,有着广泛的用途,如用于酪蛋白活性肽的制备,焙烤食品中蛋白质的强化和人造奶油的增稠等。长期以来,由于抗生素的广泛使用,病原菌的耐药性大大提高,人们迫切需要开发新型抗菌剂,其中酪蛋白抗菌肽的研究成为了新型抗菌剂研究的热点之一。本课题以酪蛋白为原料,用胰蛋白酶进行酶解,并对酶解物进行分离纯化,得到了具有抗菌活性的物质,并测定了该物质的分子量。本课题主要由四个部分组成。第一部分,胰蛋白酶酶解酪蛋白条件的优化。以水解度为指标,通过单因素实验研究了底物浓度、酶底比,pH和温度对酶解的影响,确定了单因素实验的最佳条件。在此基础上,采用Box-Behnken中心组合设计,通过响应面分析对水解条件进行了优化。单因素实验结果表明:底物浓度50mg/mL、酶底比1.5%、pH值8和温度55℃为水解的适宜条件;进一步的响应面分析结果表明,胰蛋白酶水解酪蛋白的最适条件为:底物浓度47.2mg/mL,酶底比1.92%,pH值8.31和温度54.8℃。第二部分,确定酪蛋白抗菌肽释放的最适水解时间。根据文献报道的酪蛋白抗菌肽分子量,选用切割分子量10000或20000的聚醚砜膜超滤分离不同水解时间的酪蛋白水解物,采用滤纸片扩散法法或洋菜孔洞扩散法测定透过液的抑菌效果。结果表明超滤分离的适宜条件为:进口压力为0.03MPa,出口压力为0.01MPa,渗透流速为20mL/min;胰蛋白酶水解酪蛋白释放抗菌肽的最佳水解时间为4.5h。第三部分,研究酪蛋白酶解物中抗菌肽的稳定性及抑菌特性。以大肠杆菌为指示菌,研究了酪蛋白酶解物中的抗菌肽在高温、不同pH、不同贮藏时间时的稳定性,并以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌为指示菌,研究了酪蛋白酶解物中的抗菌肽的抑菌特性。结果表明:酪蛋白酶解物中的抗菌肽能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌,具有广谱抑菌特性;酪蛋白酶解物中的抗菌肽对高温稳定;碱性条件下,酪蛋白酶解物中的抗菌肽对大肠杆菌抑菌性能稳定,在酸性条件下其抑菌性能增强;干燥后的产品在室温下耐贮藏。第四部分,用离子交换层析分离纯化酪蛋白酶解物中的抗菌肽并测其分子量。选用Q-Sepharose Fast Flow为分离介质,对分离条件进行了研究,并通过抑菌活性测定,确定了适宜分离条件下酪蛋白抗菌肽的洗脱体积,同时测定了酪蛋白抗菌肽的分子量。结果表明,离子交换层析对酪蛋白酶解物中的抗菌肽的分离效果较好,合适的阶梯洗脱条件为:pH10.5,洗脱流速0.5mL/min,0.07MNaCl,50mL;0.13MNaCl,45mL;0.25MNaCl,40mL;1.0MNaCl,50mL。进一步分离后,酪蛋白抗菌肽的洗脱体积为18.52mL,酪蛋白抗菌肽的分子量的测定结果为3162Da。