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神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是一种主要起源于交感神经系统,神经嵴祖细胞的内分泌性肿瘤。目前,神经母细胞瘤已经成为儿童第三大最常见的肿瘤,其年发病率约为1/10万,仅次于中枢神经系统肿瘤和白血病,约占全部儿童肿瘤的6-10%。神经母细胞瘤恶性程度高,易转移,多数患者被发现时已经处于晚期,其死亡率约占儿童癌症死亡的15%。目前,神经母细胞瘤的治疗主要以化疗、外科手术及放疗为主。但是,放疗及化疗毒副作用较大,会造成儿童认知功能障碍不良预后及耐药性。随着对神经母细胞瘤研究的不断深入,自体外周血造血干细胞移植、基因治疗、免疫治疗在神经母细胞瘤的治疗上取得了很大的进步,为儿童患者生存时间的延长提供了可能。但是,新兴的治疗手段个性化程度高,治疗效果欠佳,因此目前尚未形成成熟、有效的治疗神经母细胞瘤的措施。所以,寻找有效的神经母细胞瘤的治疗手段或者药物对于神经母细胞患者的治疗及其生活质量的提高具有重要意义。神经母细胞瘤的发病机制极其复杂,目前尚不清楚。所以,深入探究神经母细胞瘤的发病机理及其分子调控机制对于神经母细胞瘤的新的治疗靶点的发现及应用具有十分重要的作用。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类长约19-25个核苷酸的内源性的具有调控作用的非编码RNA。成熟的miRNAs主要通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并通过结合靶基因的3’非翻译区（3’-Untranslated Regions,3’-UTR）指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译,影响靶miRNA的表达。目前,研究发现miRNA可以通过调控不同的靶基因及信号通路参与不同的生物进程影响不同疾病的发生发展。同样,随着对神经母细胞瘤研究的不断深入,研究发现miRNAs在神经母细胞瘤的发生发展中起重要作用。但是,目前真正用于神经母细胞瘤的治疗的miRNA尚未发现。Gene Expression Omnibus（GEO）涵盖了包括基因组、转录组、表观遗传等多种形式的高通量或芯片实验数据。目前通过生物信息学在GEO数据库中挖掘关键的基因或非编码RNA已经被应用于基因的表达与调控、疾病的诊断、药物筛选等研究。本研究通过GEO数据库深度挖掘与神经母细胞瘤相关的核心miR-25-3p,进而通过生物信息学分析发现其靶基因人叉头框蛋白N3（Forkhead box N3,FOXN3）,表明miR-25-3p-FOXN3在神经母细胞瘤的发生发展中起重要作用;最后,通过在细胞水平对关键miR-25-3p-FOXN3在SH-SY5Y细胞增殖、侵袭和迁移中的作用进行验证分析,明确miR-25-3p-FOXN3轴在神经母细胞瘤发生发展中的作用及调控机制,为miR-25-3p在神经母细胞瘤的治疗提供理论基础。第一部分:通过GEO数据库挖掘在神经母细胞瘤中的关键miRNA目的:通过GEO数据库挖掘在神经母细胞瘤中差异表达的miRNA,并挖掘核心的miRNA及其靶基因。方法:（1）通过对 NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库列表中的 GEO datasets 分析,挖掘获得 GSE16444、GSE84841、GSE86652 和GSE121513四个miRNA微阵列数据库;（2）使用GEO数据库的软件GE02R进行差异表达miRNA,参数设置为P＜0.05和Log2（Fold change）大于1.0。差异表达基因的个数和表达分别使用韦恩图和Heatmap图展示,韦恩图和热图使用R软件作图;（3）通过TargetScanHuman7.2（http://www.targetscan.org/vert72/）、miRWalk（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）、miRDB（http.//www.mirdb.org/）及 Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测分析miRNA的靶基因。结果:（1）通过对NCBI数据库列表中的GEO datasets分析挖掘到GSE16444、GSE84841、GSE86652和GSE121513四个与神经母细胞瘤miRNA相关的阵列数据库;（2）通过维恩图分析发现在GSE121513/GSE84841/GSE86652中共有的miRNA为7个,分别为 hsa-miR-135b、hsa-miR-18a、hsa-miR-7、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-196a、hsa-miR-505和hsa-miR-135a;（3）通过对7个miRNA在不同的神经母细胞瘤数据库中的表达倍数进行分析发现miRNA-25-3p在神经母细胞瘤细胞系中的表达变化最高,作为候选miRNA进行下一步分析;（4）通过 TargetScanHuman 7.2、miRWalk、miRDB 和 Starbase 四个数据库对miR-25-3p的靶基因预测分析发现在4个数据库中共有的靶基因共有54个,包含GFPT2、PIK3CB、FAM110C和FOXN3等,结合已有研究发现FOXN3在不同的肿瘤中起重要作用,表明FOXN3在神经母细胞瘤中起重要作用,FOXN3作为miR-25-3p的候选靶基因进行进一步的验证。结论:在与神经母细胞瘤相关的四个数据库GSE16444、GSE84841、GSE86652和GSE121513中挖掘出候选的miRNA-miR-25-3p,并通过生物信息学预测分析挖掘到其靶基因FOXN3。第二部分miR-25-3p在神经母细胞瘤中的功能分析目的:通过在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中过表达或者敲低miR-25-3p的表达,在细胞水平上明确miR-25-3p在神经母细胞瘤细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移中的作用。方法:（1）使用 Lipofectamine 2000 转染 miR-25-3p mimics 或 inhibitor 分别在SH-SY5Y细胞中过表达或敲低miR-25-3p的表达;（2）分别使用CCK-8检测试剂盒检测人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞增殖;流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞周期和凋亡;Transwell方法检测SH-SY5Y细胞迁移和侵袭;结果:（1）过表达miR-25-3p促进SH-SY5Y细胞的增殖、周期、迁移及侵袭而抑制表达miR-25-3p抑制SH-SY5Y细胞的增殖、周期、迁移及侵袭;（2）过表达miR-25-3p抑制SH-SY5Y细胞的凋亡而抑制表达miR-25-3p促进SH-SY5Y细胞的凋亡;结论:miR-25-3p促进SH-SY5Y细胞的增殖、周期、迁移及侵袭,抑制凋亡,表明miR-25-3p可以促进神经母细胞瘤的发生发展。第三部分miR-25-3靶向结合FOXN3影响Wnt/β-catein信号通路促进神经母细胞瘤的发生发展目的:我们已经证明miR-25-3p促进神经母细胞瘤的发生发展,但是其作用机制并不清楚。所以,本部分内容通过验证miR-25-3p对FOXN3的调控及其影响的信号通路,明确miR-25-3p在神经母细胞瘤的发生发展的作用机制。方法:（1）TargetScan预测分析miR-25-3p对FOXN3的结合位点,双荧光素酶报告系统检测miR-25-3p对FOXN3的调控;（2）qRT-PCR 和 western blot 检测 FOXN3 的表达;Western blot 检测Wnt/β-catein 信号通路蛋白β-catenin、c-Myc、CyclinD1、GSK-3 和 APC;结果:（1）通过TargetScan数据库对miR-25-3p与FOXN3的结合进行预测分析,分析发现miR-25-3p可以结合FOXN3 3’ UTR第1619-1625位置的序列TGCAATA;（2）与对照组相比,共转染野生型FOXN3-WT-pmirGLO和miR-23-3p mimics组中LUC/RLUC值显著降低（P＜0.01）,而共转染突变型FOXN3-Mut-pmirGLO和miR-23-3p mimics组中LUC/RLUC值与对照组相比无显著性差异;（3）与对照 NC 组相比,β-catenin、c-Myc、CyclinD1 在 Si-FOXN3 组中的表达量显著提高。GSK-3和APC的表达与β-catenin、c-Myc和CyclinD1的表达呈现出相反的趋势;在Si-FOXN3组中的表达量显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。结论:miR-25-3p靶向结合FOXN3抑制Wnt/β-catenin信号通路促进神经母细胞瘤的发生发展。