论文部分内容阅读
铁是人体必需的微量元素,在人体的代谢活动中具有十分重要的作用,铁缺乏会引发缺铁性贫血。口服硫酸亚铁是治疗缺铁性贫血的传统方法,但硫酸亚铁对胃肠道刺激性较大,患者很难坚持服用,因而影响治疗效果。富铁酵母具有吸收率高、刺激性小、营养丰富等特点,作为一种安全高效的新型铁剂引起了人们的关注。从40株Aureobasidium pullulans HN6.2敲除了GATA类型转录抑制因子编码基因(SRE1)的敲除菌株中筛选得到一株富铁能力最强的菌株R6,R6菌株在加铁培养基中依然能产生大量铁载体,细胞内外铁载体总产量约12.2mg/g dw,而野生型菌株在加铁环境中铁载体合成受到强烈阻遏。利用R6菌株这一特性,通过优化加铁的时间,初步得到了富铁酵母细胞的制备方法:在缺铁培养基中培养R6菌株,培养至24h时加入终浓度为1.5mM的FeCl3,继续培养至120h,收获富铁酵母细胞。在50mL摇瓶体系中,R6菌株胞内铁离子富集量最大可达11.9mg/g dw。分别用加铁和缺铁培养基培养野生型及R6菌株,通过实时荧光定量PCR的方法研究鸟氨酸羟基化酶基因(SIDA)在两种培养条件下的相对表达量。野生型菌株在加铁培养基中的SIDA基因表达量是缺铁培养基中的27.3%,R6菌株在加铁培养基中的SIDA基因表达量是缺铁培养基中的74.1%,说明R6菌株部分解除了铁离子对SIDA基因表达的阻遏作用。铁离子阻遏的解除使敲除菌株R6在加铁培养基中铁载体产量高于野生型菌株,因而能富集更多的铁。对富铁酵母进行扩大化培养。在1.5L发酵体系中R6菌株胞内铁离子富集量为5.15mg/g dw。为提高R6菌株铁离子的富集量,在50mL摇瓶体系中对加铁浓度进行优化,得到铁离子最适终浓度为15mM。采用优化后的加铁浓度进行6L体系发酵培养,R6菌株胞内铁离子富集量最高可达27.79mg/g dw。发酵48h时,R6菌株胞内铁离子富集量已达26.59mg/g dw,且总糖已消耗96%以上,在这种情况下可提前结束发酵,这大幅度缩短了富铁酵母的制备时间。将富铁酵母试用于小鼠缺铁性贫血的治疗。首先采用急性毒性实验对富铁酵母的安全性进行评价。对健康小鼠一次性灌胃10g/kg富铁酵母,连续观察14天,小鼠未出现中毒和死亡,表明富铁酵母安全无毒。通过低铁饮食辅以慢性失血的方法成功制备了小鼠的缺铁性贫血模型,贫血小鼠血红蛋白含量降为89g/L,红细胞计数降为5.9×1012cells/L。与正常小鼠相比,模型小鼠体重增长缓慢,表明铁缺乏影响了小鼠的正常生长。对贫血模型小鼠连续10天灌胃富铁酵母混悬液,10天后贫血小鼠血红蛋白含量恢复至128g/L,红细胞计数恢复至7.5×1012cells/L。富铁酵母能显著提高缺铁性贫血小鼠的血红蛋白含量和红细胞计数(P<0.05),证明富铁酵母对缺铁性贫血小鼠具有良好的治疗效果。