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α-淀粉酶是一类水解淀粉α-1,4糖苷键从而将其水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。随着应用需求的增加及生物技术的愈加成熟,提高其稳定性及水解活力具有重要的意义。本论文以目前用于工业生产的来源于Cytophaga sp.和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的淀粉酶基因CamyA和BamyA为材料,成功实现了在枯草芽孢杆菌中的异源表达,通过理性设计有效提高其热稳定性和水解活性,同时通过动力学模拟探究了淀粉酶CamyA热稳定性及水解活力提高的机制。枯草芽孢杆菌表达的淀粉酶CAMYA最适温度为55°C,最适pH为7.0,70°C下处理5 min后剩余酶活为26%,在pH 1.0-6.0条件下不稳定。以可溶性淀粉为底物时,比活为5,550 U·mg-1。对其动力学常数进行了测定,Km为3.19 mg·mL-1,Vmax为6,534μmol·min-1·mg-1。通过不同性质淀粉酶的序列及结构分析,设计突变体CAMYA-ΔR178/ΔG179和CAMYA-S33A/S34E/V35H。突变体ΔR178/ΔG179在70°C下处理5 min后剩余酶活为70%;80°C处理5 min后,ΔR178/ΔG179和野生型剩余酶活分别为28%和8%。而突变体S33A/S34E/V35H表现更高的催化活性,比活较野生型提高1倍(10,725 U·mg-1 vs.5,550 U·mg-1),催化效率提高2.3倍。两者组合后得到S33A/S34E/V35H/ΔR178/ΔG179,在70°C和80°C下处理5 min后剩余酶活分别为90%和40%,比活为15,594 U·mg-1,是野生型的2.8倍。模拟轨迹显示,删除R178和G179这两个氨基酸后Loop区变短,淀粉酶结合Ca2+能力增强,从而热稳定性提高。突变后使得淀粉酶由Ca2+依赖型转变为非Ca2+依赖型,可能由于Ca2+结合力增强后,结合的Ca2+不容易丢失,从而在后面的反应中不需要再额外添加。突变位点S33A/S34E/V35H处于淀粉酶的N端结构域,突变后Km值明显降低,推测该部分突变使酶与底物亲和能力增强,从而提高催化活力。用15 L发酵罐进行90 h发酵后,组合突变体酶活为355,800 U·mL-1,蛋白量为23 mg·mL-1。为验证S33A/S34E/V35H位点突变效果的普适性,我们选取了目前工业广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶BAMYA在同样位点进行突变,设计突变体S61A/D62E/I63H,在芽孢杆菌中进行表达后重组酶的比活为10,744 U·mg-1,比野生型提高57%(6,835 U·mg-1)。野生型BAMYA和突变体BAMYA-S61A/D62E/I63H的Km值、Vmax及催化效率分别为3.58 mg·mL-1和2.97 mg·mL-1,6,534μmol·min-1·mg-1、16,628μmol·min-1·mg-1以及1,577 mL·s-1·mg-1和3,042mL·s-1·mg-1。另外通过与高比活的序列和结构分析发现,BAMYA的C端位点473-475位的L K N位点可能与酶的催化相关,设计突变位点L473K/K474H/N475K,表达后比活为10,148 U·mg-1,比野生型提高48%。Km值、催化效率分别为2.21 mg·mL-1和4,760 mL·s-1·mg-1。但上述二者的组合突变效果不明显。本研究利用定点突变的方法,有效提高了目前工业应用的淀粉酶的热稳定性和催化活性,获得的突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率,同时为淀粉酶突变研究提供参考。