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胶质母细胞瘤(Gliomablastoma)为最常见的神经系统原发性肿瘤。当前对胶质母细胞瘤的治疗治疗仍以传统手术为主,辅以放、化疗,但由于其呈现的浸润性生长特点,无法与正常脑组织界定,手术无法清除所有肿瘤组织,术后易复发。同时由于胶质母细胞瘤发病部位多样性,对占位处功能区侵袭破坏,致残、致死率均较高于常见脑部疾病,严重影响患者预后。常用的抗胶质母细胞瘤药物主要通过细胞毒做作用,抑制增殖、诱导细胞凋亡等实现对肿瘤的控制,但由于毒副作用较强,对正常脑组织损伤大,且易形成耐药性,严重影响着患者的治疗效果和生存质量。因此,研发新型抗胶质母细胞瘤药物已成为胶质母细胞瘤研究的热点。南蛇藤(Celastrus orbiculatun Thunb)为卫矛科南蛇藤属落叶木质藤本植物,又名:过山枫、挂廓鞭、过山龙、大南蛇等。味苦、辛,性微温,归肝、脾、大肠经。作为药材,首载于《植物名实图考》,其根、藤具有祛风消肿、活血止痛之功效,可用于治疗跌打损伤、腰腿痛等症。本课题组在前期的体内外实验研究中发现,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extract,COE)对胶质母细胞瘤细胞的侵袭、转移均具有显著干预作用,但其对胶质母细胞瘤凋亡影响的具体机制尚不完全清楚,因此本课题拟对COE诱导胶质母细胞瘤U251细胞凋亡及相关具体分子机制进行研究。本研究通过不同分子生物学方法,研究COE对人胶质母细胞瘤细胞系凋亡的干预作用,阐明其影响的分子机制,为中医药抗脑肿瘤提供机制支持,为开发针对胶质母细胞瘤具有自主产权的中医药提供理论依据。第一部分 南蛇藤提取物对胶质母细胞瘤细胞的影响目的:研究不同浓度的COE对人胶质母细胞瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法:对数生长期人胶质母细胞瘤U251细胞随机分为对照组和治疗组(治疗组分别予质量浓度为10,20,40,80,160,320μg/mL的COE作用),以MTT法分三个时间点(24h,48h,72h)检测细胞活力。根据MTT结果,排除细胞毒作用选择低中高浓度(40,80,120 μg/mL)的COE作为后继实验浓度。阴性对照组、阳性对照药物(替莫唑胺,Temozolomide,TMZ,40 μM))及 COE(40,80,120 μg/mL)干预 U251 细胞 24 h 后,AnnexinV/FITC-PI双标法流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1检测线粒体膜电位变化。结果:不同浓度COE作用24、48、72h后,U251细胞的增殖受到不同程度的抑制,并呈时间和浓度依赖性;根据COE对细胞增殖的抑制率,计算COE对U251细胞24 h的IC50为127.06μg/mL。不同浓度COE作用24h后,随着COE浓度的增加,U251细胞凋亡率逐渐增加,线粒体膜电位逐渐降低,且COE作用效果较TMZ明显。结论:COE能够抑制人胶质母细胞瘤U251细胞增殖且呈浓度、时间依赖;COE能够干预线粒体膜电位,进而通过线粒体途径诱导U251细胞的凋亡。第二部分 南蛇藤提取物通过线粒体途径及影响微丝骨架重塑促进人胶质母细胞瘤U251细胞凋亡的分子机制目的:透射电镜观察COE干预后胶质母细胞瘤U251细胞超微结构变化,探讨COE对U251细胞凋亡相关线粒体途径及微丝骨架重塑的作用。方法:透射电镜观察人胶质母细胞瘤U251细胞经对照组及COE(80μg/mL)作用24 h后超微结构的改变。不同浓度(40,80,120μg/mL)的COE作用于人胶质母细胞瘤U251细胞24 h后,Western blot检测细胞中线粒体凋亡相关蛋白表达水平的变化。免疫荧光染色观察COE干预后胶质母细胞瘤细胞微丝骨架改变;Western blot检测COE干预24 h后U251细胞骨架凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果:经COE(80μ/mL)作用后U251细胞肿胀,线粒体数目增多,体积变小,线粒体脊减少,管网状结构崩溃;微丝排列紊乱。Western blot实验结果表明,经不同浓度COE作用后Bcl2L12、Bcl-2蛋白表达下调,Bax、Cyt-C、Caspase-3蛋白表达上调,且高浓度COE作用时,变化较TMZ组更为明显。免疫荧光实验表明,COE及Lat A作用后细胞微丝分布由细胞中心向四周改变;Western blot实验结果显示,经COE和Lat A作用后微丝骨架凋亡相关PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达下调,Caspase-3蛋白表达增高。上述变化在COE联合Lat A组改变更为明显。结论:COE能够通过线粒途径能诱导U251细胞凋亡;COE能够引起胶质母细胞瘤细胞微丝骨架重构,进而导致U251细胞凋亡。第三部分 南蛇藤提取物对人胶质母细胞瘤异种移植瘤的干预及分子机制目的:体内观察COE对荷瘤裸鼠皮下异种移植瘤的抑制作用及相关分子机制。方法:取2×106个对数生长期人胶质母细胞瘤U251细胞种植于裸鼠皮下,经三周成瘤后随即分为3组,阴性对照组、COE治疗组和阳性对照组。其中COE治疗组和阳性对照组分别于COE和TMZ 40 mg/kg/d灌胃治疗,对照组予等量生理盐水灌胃,每3 d称量裸鼠体重和皮下移植瘤长短径,每7 d拍摄活体荧光成像,21 d后PBS灌注分离皮下荷瘤,瘤体称重拍照;免疫组织化学法检测瘤组织线粒体凋亡相关蛋白及微丝骨架相关蛋白表达的变化。结果:COE及TMZ干预组瘤体生长速度及瘤重均小于对照组,且COE的抑瘤作用更为明显。免疫组化结果显示Caspase-3、Bax、p-Akt蛋白表达水平上调,Bcl-2、PI3K、Akt蛋白表达下调。结论:COE能明显抑制皮下异种移植胶质母细胞瘤组织增长,且抑制作用较TMZ更为明显。其作用机制可能与线粒体凋亡功能激活及肿瘤细胞微丝骨架重塑有关。