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目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤。多数肝癌患者在确诊时已达疾病晚期,失去最佳手术切除时机。索拉菲尼是一种多靶点激酶抑制剂,是目前国内外使用较多的晚期HCC靶向药之一。许多因素会导致肝癌耐药,其中一个重要因素就是自噬的激活。自噬不仅可以通过抑制肿瘤的能量代谢、增殖和转移,抑制肿瘤的进程。同时也有助于维持肿瘤细胞产物合成及代谢的平衡,是缺乏营养的肿瘤细胞获取能量的主要代谢机制。其中自噬相关基因(Autophagy-related genes,ATGs)发挥了重要的调控作用。微RNA(microRNA,miRNA)可通过与mRNA的3’UTRs(Untranslated Regions)端近乎完全互补性的结合,从而在基因表达中起着至关重要的调控作用。本研究针对miR-375靶向结合ATG14影响肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性的机制展开了一系列研究,逐步揭示miR-375调控自噬从而影响肝癌细胞对索拉菲尼敏感性的分子机制,为肝癌治疗以及对治疗药物再敏感提供理论依据。研究方法:1.利用GEO数据库、KEGG基因富集分析等生物信息学方法确定索拉菲尼与自噬的关系。2.通过western blot检测索拉菲尼处理下肝癌细胞Huh7的自噬标志性蛋白LC3与P62的表达情况;采用免疫荧光观测索拉菲尼处理下肝癌细胞Huh7的LC3含量的表达情况;透射电镜观察索拉菲尼处理下肝癌细胞Huh7自噬小体情况。3.抑制肝癌细胞Huh7自噬的发生后,分别行细胞增殖实验(MTT)、平板克隆形成实验与流式细胞凋亡实验观测肝癌细胞生长数目的变化。4.利用生物信息学和实验学方法确定研究对象miR-375。采用脂质体转染技术,构建高表达miR-375的肝癌细胞系。5.通过miR-375 mimics转染肝癌细胞,实验对象分为4组:对照组、索拉菲尼处理组、mi R-375 mimics组、索拉菲尼处理加转染miR-375 mimics组。分别利用western blot检测自噬标志性蛋白LC3与P62的表达情况;免疫荧光观测LC3含量的表达情况;透射电镜观察自噬小体情况。6.生物信息学手段初步筛查研究对象miR-375的靶点,同时采用real-time PCR手段检测筛选的指标在肝癌细胞中的表达情况;利用荧光素酶报告基因(Luciferase reporter assay)验证miR-375是否直接靶向结合ATG14。共转染miR-375 mimics和pcDNA3.1-ATG14后加入索拉菲尼药物处理,利用MTT法检测转染组和对照组细胞活性状态,克隆形成实验检测肿瘤细胞生长水平的改变。结果:1.生物信息学分析结果显示,在肝癌组织中索拉菲尼处理与自噬成正相关性,差异有统计学意义(P<0.01)。2.Western blot结果显示索拉菲尼处理下肝癌细胞中自噬标志性蛋白LC3-II/LC3-I的比值提高与P62的表达下降。3.免疫荧光观测得出索拉菲尼处理下肝癌细胞中LC3绿荧光含量增多。4.透射电子显微镜观察索拉菲尼处理后出现自噬小体增多现象。5.阻断肝癌细胞Huh7自噬的发生后,分别行细胞增殖实验(MTT)、平板克隆形成实验与流式细胞仪凋亡实验发现肝癌细胞生长存活数目变少与凋亡增多现象,差异有统计学意义(P<0.01)。6.利用GEO数据库等生物信息学方法以及real-time PCR实验显示miR-375在索拉菲尼处理的肝癌细胞中表达最低。7.Western blot检测结果发现索拉菲尼处理加转染miR-375 mimics组的自噬标记性蛋白表达降低。8.免疫荧光观测索拉菲尼处理加转染miR-375 mimics组LC3绿色荧光点含量比索拉菲尼处理组少。9.透射电镜观测出索拉菲尼处理加转染mi R-375 mimics组自噬小体减少。10.索拉菲尼处理加转染miR-375 mimics组的细胞发生数目变少与凋亡增多现象。11.生物信息学手段初步筛查研究对象miR-375的靶点,同时采用real-time PCR检测筛选的指标在肝癌细胞中的表达情况,发现ATG14表达最高。12.荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter assay)发现,mi R-375明显抑制了野生型ATG14-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型ATG14-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响(P>0.05)。13.Western blot实验结果发现相比于对照组索拉菲尼处理加转染miR-375 mimics组的ATG14蛋白水平降低。14.ATG14可以逆转miR-375诱导的细胞生长、增殖减少和凋亡增多现象。结论:1.采用GEO数据库与富集分析结果显示肝癌组织样本中索拉菲尼与自噬存在功能上的相关性;索拉菲尼能够促进肝癌细胞自噬表达的增加;抑制自噬能提高肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性。2.研究对象确定为miR-375;miR-375抑制索拉菲尼诱导的自噬;miR-375提高肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性。3.miR-375通过靶向ATG14调控自噬从而影响肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性。