Kappa型阿片受体(KOR)及其内源性配体强啡肽(dynorphin)广泛分布于中枢神经系统，KOR结合配体后，经典的G蛋白通路的活化与KOR镇痛功能的实现密切相关，而非G蛋白依赖性通路的激活，尤其是β-arrestin依赖的信号通路活性的明显增强，往往直接引发KOR相关的负性情绪的出现。多项研究表明，在强迫行为以及习惯行为的养成方面有着重要作用的纹状体，KOR及其配体dynorphin的显著上调已被公认为是药物成瘾的明显标志，并且上调的KOR/dynorphin系统偏向性选择β-arrestin2依赖的信号通路，参与药物滥用以及药物成瘾的形成。因此，探寻纹状体内KOR激活后偏向性选择β-arrestin依赖的通路进行信号转导的根本原因，显然成为阐明药物滥用及成瘾机制研究中亟待解决的关键问题。　　利用免疫荧光染色结合原位邻位连接技术(PLA)，我们不仅发现KOR及NTSR1共定位于体外培养的纹状体神经元，并且初步鉴定KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达。本实验拟在前期工作的基础上，进一步确认KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系，并对KOR-NTSR1异源二聚体对KOR介导的信号转导的可能影响进行了研究:　　(1)通过构建多种KOR、NTSR1融合表达载体，瞬时或稳定转染HEK293细胞，建立KOR和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示，各受体单表达组与共表达组细胞之间，受体表达量无明显差异;同时，免疫荧光染色结合共聚焦扫描观察，发现KOR、NTSR1主要定位于细胞膜上，表达均匀。提示，细胞模型构建正确，KOR、NTSR1融合表达载体表达稳定。　　(2)通过SOE-PCR技术，对KOR TM4区域184以及196位氨基酸进行点突变，将上述位点亮氨酸突变成丙氨酸。成功构建KOR184、KOR196突变体后，瞬时或稳定转染HEK293细胞，建立KOR184/196和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。通过免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示，各单表达与共表达组细胞内，KOR184/196的受体表达量与野生型KORWT相比较，无明显差异;免疫荧光染色结合共聚焦扫描显示，各单表达与共表达组细胞内，KOR184/196主要定位于细胞膜上，表达均匀稳定，与KORWT类似。　　(3)经BRET、FRET、CO-IP分析，发现KORWT、KOR184能与NTSR1发生异源二聚化，但KOR196与NTSR1无异源二聚化相互作用，提示:KOR的196位亮氨酸是KOR-NTSR1异源二聚体形成的关键位点;同时，KOR196与NTSR1共表达的细胞，可以作为异源二聚化结合的阴性对照，应用于KOR-NTSR1异源二聚体信号转导机制的实验研究。　　(4)通过细胞内cAMP水平的分析发现，在KOR、KOR184、KOR196独立表达组，给予dynophin A(1-13)刺激，FSK诱导的cAMP生成均受到明显的抑制:KORWT:最大抑制率=66.5％;KOR184:最大抑制率=70％;KOR196:最大抑制率=63.9％。但在KORWT/NTSR1和KOR184/NTSR1共表达细胞内，dynophin A(1-13)仅引起细胞内cAMP水平轻微下降:KORWT:最大抑制率=14.7％;KOR184:最大抑制率=14.9％，而在KOR196/NTSR1组，cAMP水平与KOR196独立表达组相近。实验表明，异源二聚化结合NTSR1之后，dynorphin A(1-13)激活KOR后，对腺苷酸环化酶的抑制作用明显减弱。　　(5)为了验证cAMP结果，我们通过eBRET动态监测，对KOR偶联Gi蛋白的能力进行了分析。结果发现，KORWT/NTSR1和KOR184/NTSR1共表达细胞内，给予dynophinA(1-13)刺激时，KORWT/184与Gi蛋白的结合峰值明显低于KORWT/184独立表达组，而KOR196/NTSR1共表达组内，KOR196与Gi蛋白的结合与KOR196独立表达组相似。提示，异源二聚化结合NTSR1后，给予dynorphin A(1-13)时，KOR WT/184偶联Gi蛋白的能力明显下降。　　(6)结合BRET1和eBRET检测发现，异源二聚化结合NTSR1之后，dynorphinA(1-13)刺激下，KOR WT/184与β-arrestin1/2的结合峰值明显高于KOR WT/184独立表达组，说明KOR WT/184募集β-arrestin1/2的能力明显增强，表现出明显的剂量依赖性以及时程上的延长:KOR WT/184与NTSR1共表达组，KOR WT/184与β-arrestin1/2的结合可延续到给药2h，而KOR WT/184独立表达组，仅维持到30min左右。　　(7)对ERK1/2磷酸化水平进行免疫印迹分析发现，异源二聚化结合NTSR1之后，dynorphin A(1-13)刺激下，KORWT/184介导的ERK1/2磷酸化表现出明显的时程上的改变，出现给药15min之后的持续性ERK1/2活化，且该持续性的ERK1/2磷酸化(30min)表现出明显的剂量依赖性。KOR196与NTSR1共表达组，未观察到与KOR196独立表达组存在ERK1/2磷酸化在时程上的差异。　　(8)为了探究KOR-NTSR1所介导的持续性的ERK1/2磷酸化的诱因，我们进一步进行了β-arrestin1/2shRNA以及PTX干预实验。β-arrestin1/2shRNA分析发现，虽然β-arrestin2几乎不参加dynorphin A(1-13)激活KORWT单体后ERK1/2的磷酸化，但是，在KORWT和NTSR1共表达的HEK293细胞，在转染β-arrestin2shRNA后，本来在30min时间点出现的较强的ERK1/2的磷酸化几乎完全消失，甚至在5min时间点的早期磷酸化也受到明显的影响，与转染control shRNA的同组细胞于相同的时间点相比较，表现出明显的削弱。通过Gi/o蛋白的选择性抑制剂PTX干预实验发现，KORWT独立表达组，PTX预孵育后，dynorphin A(1-13)诱导的早期快速磷酸化（5min时间点）几乎完全消失，而在KORWT/NTSR1共表达的细胞内，PTX对dynorphin A(1-13)诱导的早期ERK1/2磷酸化抑制率仅余40％左右。β-arrestin1/2shRNA和PTX实验结果提示，与NTSR1发生异源二聚化结合后，KOR所介导的G蛋白依赖的信号转导通路的活性明显削弱，同时β-arrestin2依赖通路的活性明显增强，　　(9)通过细胞内cAMP水平的检测以及BRET分析，对于KORWTT1/84和NTSR1共表达的细胞，NT(8-13)单独作用时，对FSK诱导的cAMP水平的升高，没有抑制作用，同时不会引起KOR WT/184偶联Gi蛋白、结合β-arrestin1/2;在给予NT(8-13)+dynorhpinA(1-13)共刺激时，KOR WT/184对cAMP生成的抑制作用、偶联Gi蛋白的能力以及募集β-arrestin1/2的能力均恢复到dynorhpin A(1-13)刺激KORWT/184独立表达组细胞的水平。即给予NT(8-13)共刺激，能有效逆转因KOR WT/184-NTSR1异源二聚体形成所致的，KOR介导的腺苷酸环化酶活性抑制作用的降低、KOR偶联Gi蛋白能力的降低以及对β-arrestin1/2募集能力的显著增强。　　(10)结果提示，NTSR1的激活与否，是决定KOR-NTSR1异源二聚体中KOR选择G蛋白依赖性或β-arrestin2依从性信号通路的关键因素。　　综上所述，本实验首次原代培养的纹状体神经元，证实了KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达，并于转染的HEK293细胞内确认了KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系;通过观察与Gi蛋白、β-arrestin1/2结合能力、对cAMP抑制作用以及对ERK1/2活化等方面的研究发现，与NTSR1发生异源二聚化相互作用后，KOR介导的Gi依赖的通路明显减弱，同时非G蛋白依赖的通路，尤其是β-arrestin1/2依赖的信号转导明显增强。　　实验结果充分证实了“NTSR1是纹状体内KOR的工作伙伴”的假设，本研究为纹状体内KOR偏向性选择β-arrestin依赖的通路的现象提供了坚实的实验依据，也为阐明药物滥用及成瘾的机制提供可靠的理论依据。本研究同时还发现NTSR1的激活，可以逆转基于KOR-NTSR1异源二聚化作用而发生的KOR信号通路的转换，促使KOR经由经典的Gi依赖的通路进行信号转导，该结果不仅为NT/NTSR1系统参与痛觉调制以及安定作用的实现提供了理论基础，也为充分发挥病理状态下明显上调的KOR/dynorphin系统的作用提供新的理论支持;本研究同时为药物滥用及成瘾的防治提供了新的思路，并为新型抗成瘾药物的开发提供了有效的作用靶点，具有重要的实际意义和临床应用前景。