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目的:鉴于化瘀通络方治疗糖尿病肾病临床疗效确切,且前期实验证实其对糖尿病肾病Sprague-Dauley大鼠肾组织ACE2—Ang-(1-7)—Mas通路具有活化作用,本实验将化瘀通络方拆解为化瘀中药与通络中药对动物模型进行干预治疗,通过通过观察大鼠的一般情况、24小时尿蛋白定量、血生化指标、血凝指标、肾脏病理及肾组织ACE2的表达水平,对比化瘀中药与通络中药对糖尿病肾脏的保护作用及其可能的机制,为临床应用提供实验基础及理论依据。方法:选用清洁级健康雄性SD大鼠60只,体重60g-80g。普通饲料适应性喂养1周后,测定随机血糖、24小时尿蛋白定量均为阴性者用于本实验,按体重随机选取正常组(C组)10只,造模大鼠50只,正常组继续给予普通饲料喂养,造模组给予高脂饲料喂养。4周后,所有大鼠禁食不禁水12小时以上,造模组大鼠按35mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)溶液,正常组大鼠给予相应体积的枸橼酸缓冲液腹腔注射。72小时后测随机血糖≥16.7mmol/L者则为造模成功。造模成功大鼠共45只,随机分为模型组(M组)12只、厄贝沙坦组(I组)11只、通络组(T组)11只、化瘀组(H组)11只。造模成功后,各治疗组给予相应药物灌胃,正常组及模型组予等体积纯净水灌胃,每日一次,连续给药共16周。分别于给药第2、4、8、16周末收集24小时尿液,检测24小时尿蛋白含量,并于给药16周末,尾静脉取血测随机血糖。大鼠禁食不禁水12小时,称量体重,麻醉动物,腹主动脉取血分离血清,用于检测血液指标,留取肾组织进行光镜、电镜、免疫组化、反转录酶-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction,RT-PCR)以及蛋白免疫印迹法(Western-blotting)检测分析。结果:1大鼠一般状况比较C组大鼠体重逐渐增加,精神状态良好,眼睛有神,反应敏捷,活动自然,毛色光泽,肌肉丰满,无畸形,饮水及饮食量正常,尿量正常,粪便呈麦粒状。造模各组大鼠均于腹腔注射STZ后出现明显的多饮、多食、多尿症状,体重相对C组大鼠减轻,精神萎靡,少动抱团,肌肉消瘦,毛色晦暗,甚至毛发脱落,卷曲拱背,骨骼突出,尾巴苍白且尾部静脉瘀紫明显。上述症状M组大鼠最为严重。在给药第16周时各治疗组大鼠一般情况与M组比较均有不同程度的缓解。2不同时间点各组大鼠24小时尿蛋白定量比较不同时间点M组及各治疗组的24小时尿蛋白定量均明显高于C组;第16周末,与M组相比,各治疗组24小时尿蛋白定量明显降低(P<0.05),各治疗组组间比较无统计学差异(P>0.05)。3各组大鼠随机血糖比较与C组相比,M组和各治疗组随机血糖均显著升高(P<0.05);M组与各治疗组及各治疗组组间比较不具有统计学意义(P>0.05)。4各组大鼠胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白比较M组及各治疗组总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平较C组均明显升高(P<0.05)。与M组相比较各治疗组总胆固醇水平降低(P<0.05),各治疗组组间比较无统计学差异(P>0.05)。与M组相比,T、H两组甘油三酯及低密度脂蛋白水平均明显降低(P<0.05),I组无统计学差异(P>0.05);T、H两组比较甘油三酯及低密度脂蛋白均无显著差异(P>0.05)。5各组大鼠血肌酐、尿素氮比较与C组相比较,M组及各治疗组尿素氮、血肌酐均明显升高(P<0.05);M组与各治疗组以及各治疗组组间比较尿素氮无统计学差异(P>0.05);与M组比较,各治疗组血肌酐明显降低(P<0.05),各治疗组组间比较无显著差异(P>0.05)。6各组大鼠血浆纤维蛋白原比较与C组相比,M组和各治疗组血浆纤维蛋白原明显升高(P<0.05);与M组比较,I组无显著差异(P>0.05),T、H组明显降低,T、H组间比较无统计学意义(P>0.05)。7肾组织形态学观察7.1光镜观察C组大鼠肾脏结构正常清晰;M组大鼠肾小球肥大,肾小囊腔裂隙样改变,甚至存在球囊粘连,基底膜明显增厚,系膜基质增多;与M组相比,各治疗组病理改变均有所减轻。7.2电镜结果C组大鼠肾组织结构正常清晰;M组大鼠肾小球毛细血管基底膜均质样增厚,部分足突融合,系膜基质增多;与M组相比,各治疗组大鼠病理改变程度均有减轻。8免疫组化技术测定大鼠肾组织ACE2的表达,结果显示ACE2在肾小球及肾小管中均有表达。9 RT-PCR测定各组大鼠肾皮质ACE2 m RNA的表达与C组比较,M、I、T、H组第16周末肾皮质ACE2 m RNA的表达降低(P<0.05);与M组比较,I、T、H组表达升高(P<0.05);各治疗组组间比较无统计学意义(P>0.05)。10 Western-blotting检测各组大鼠肾组织ACE2蛋白的表达与C组相比,M、I、T、H组ACE2蛋白表达量减少(P<0.05);与M组相比,各治疗组ACE2蛋白表达量增加(P<0.05);各治疗组间比较,无统计学意义(P>0.05)。结论:1结合大鼠随机血糖、24小时尿蛋白定量、光镜、电镜等变化证明DN模型制备成功;根据血脂、血浆纤维蛋白原结果,证实DN大鼠存在高凝高黏状态,符合中医瘀血阻络证。2化瘀中药、通络中药及厄贝沙坦可以改善DN大鼠一般情况,减缓蛋白尿的增加,维持肾功能,减轻DN病理损害,对DN大鼠具有肾脏保护作用。3根据血脂及血浆纤维蛋白原结果比较,化瘀中药、通络中药能够调节DN大鼠脂质代谢,改善其高凝状态,此方面作用优于厄贝沙坦。4 DN大鼠肾皮质ACE2表达量降低,化瘀中药、通络中药可上调ACE2表达量,提示化瘀中药及通络中药延缓DN进展的靶点之一为ACE2,其作用机制可能与阻断RAS有关。5综上对比,化瘀中药与通络中药对DN大鼠肾组织ACE2的影响及肾脏保护作用相当。