白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其它造血组织中白血病细胞增生积聚，并浸润其它器官和组织，使正常造血受抑制。急性白血病已经成为儿童时期最常见的恶性肿瘤。目前，对白血病的治疗包括化疗、中西医结合治疗、生物制剂治疗、骨髓移植治疗等多种治疗手段。这些方法的效果不尽理想。如化疗的副作用明显，给患者带来严重的不良反应。采用自体细胞移植的方法虽然会优于化疗的疗效，但其复发率太高，对于预后及生存率也缺乏统计学数据的支持。RNA干涉技术成为了近年来一些新兴疾病的诊疗技术。如果能够找到相关疾病的致病基因，就可以对其进行干预进而达到有效阻止相关疾病发生发展的进程。CREB作为cAMP应答元件结合蛋白的相关基因，是真核细胞的核内蛋白质，对调节细胞转录及促进细胞增殖具有重要的意义。关于CREB基因在急性白血病中的相关作用的研究越来越多。相关的实验表明，如果减少CREB的量就可以抑制相关肿瘤细胞的存活和生长。据此推测，细胞内CREB的量与细胞的生长和存活状态相关，有可能用作细胞对化疗反应的判断标准。本实验通过采用基因治疗中的RNAi技术，将细胞内的CREB基因作为治疗靶点，构建了针对CREB基因的RNAi质粒。并在体外将质粒成功导入急性白血病的细胞中去。在体外通过RT-PCR技术，Western-blot技术，流式细胞仪技术，MTT法等检测急性白血病细胞的凋亡情况。进而验证RNAi对CREB基因进行干涉后产生的肿瘤抑制效应。实验目的：研究通过体外RNAi技术对CREB基因进行抑制从而达到对急性白血病细胞的抑制效果。实验方法：（1）根据RNAi序列筛选的原理，在体外成功设计出针对CREB的RNAi模板，采用限制性内酶对质粒进行切割，之后利用T4连接酶将线性化的质粒载体同目的基因相连接，建出CREB基因的RNAi质粒，即psilencer1.0-CREB-siRNA质粒。（2）在体外制备DH5α感受态的细胞，将重组的质粒转化感受态细胞，然后提取重组的质粒，并且进行重组质粒的鉴定。再进行重组的质粒对急性白血病细胞的转染。按照以下的方法对转染进行分组，一共分为四个组：siRNA的重组质粒组；control的重组质粒组对照组；空白载体的对照组；无菌水的对照组。相应的实验分组和转染完成后，在体外制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质进行电转移，封闭，一抗和二抗的结合，显色和照相等一系列的步骤完成蛋白质免疫印迹的实验；将转染细胞内的RNA进行提取，并对其进行定量，获得cDNA并进行逆转录反应，合成相关引物进行PCR反应。通过对PCR产物进行鉴定检测CREB的mRNA的在细胞内的表达水平；采用流式细胞仪技术检测急性白血病细胞的凋亡情况；采用MTT法检测活细胞的存活率，从而判断出RNAi的对CREB基因的抑制效果。实验结果：（1）经相关的酶切鉴定，证实了psilencer1.0-CREB-siRNA质粒构建成功。（2）通过体外Western-blot技术检测psilencer1.0-CREB-siRNA质粒的成功导入后，空质粒组和psilencer1.0-U6-control-siRNA重组质粒组的蛋白质没有明显的差异，而psilencer1.0-U6-CREB-siRNA重组质粒组的蛋白质明显减少，较前两个组减少72.1%，差异具有统计学意义。说明psilencer1.0-U6-CREB-siRNA重组质粒能明显抑制CREB蛋白质的表达。（3）利用RT-PCR技术检测psilencer1.0-CREB-siRNA质粒的成功导入抑制了CREB相关基因的表达，结果显示psilencer1.0-U6-CREB-siRNA重组质粒的mRNA的表达情况明显低于空质粒组和psilencer1.0-U6-control-siRNA重组质粒（P<0.01），抑制率达到71.7%，而β-actin为内参照在各组间没有差异（P>0.05）。（4）利用MTT法检测细胞增殖情况，结果显示：psilencer1.0-U6-CREB-siRNA重组质粒转染后培养的细胞生长受到抑制，48h和72h的抑制率分别达到55.4%和57.3%，与其他组比较具有明显的统计学差异。（P<0.01）（5）利用流式细胞仪技术检测psilencer1.0-CREB-siRNA诱导细胞凋亡的机制，检测结果显示：重组质粒能够将细胞周期阻断在G0/G1期，能够在正常2倍体峰以前就出现亚二倍体峰，具有较高的凋亡率。实验结论：成功构建了psilencer1.0-U6-CREB-siRNA基因的U937细胞系，其中的CREB基因无论是从mRNA水平还是蛋白质水平都明显下降。利用流式细胞仪和MTT法检测出实验组出现明显的细胞凋亡现象。该实验结果显示CREB RNAi分子可以作为治疗急性白血病的治疗分子。