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本研究运用细胞培养、细胞增殖分析和Western bloting等细胞分子生物学技术,选用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素和靶向耗竭胞内钙离子鳌合剂BAPTA/AM,综合研究和观察了hsBAFF促进B细胞增殖与上调Erk,Akt/mTOR信号的关系,探讨了hsBAFF是否上调[ca2+]I介导PP2A-Erk和mTOR信号转导促进B细胞增殖的分子机理。结果如下:
1、hsBAFF抑制PP2A活性激活Erk和mTOR信号促进B淋巴细胞增殖研究
采用抗CD-19磁珠分离纯化B淋巴细胞。分离的B淋巴细胞接种到96孔培养板,实验分为对照组、标准品2μg/ml hBAFF刺激组、不同浓度hsBAFF(25、5、10μg/ml)刺激组,以及hBAFF+或hsBAFF+anti-IgM共刺激组,每组3个重复。采用MTT法分析hsBAFF对B淋巴细胞增殖作用。另取脾B淋巴细胞接种到六孔培养板,剂量效应组浓度同上,时间效应组设5μg/ml hsBAFF单刺激和加anti-IgM共刺激分别处理0、0.5、2、6、12、24 h,Western Blot分析Erk、PP2A、Akt/mTOR表达。结果显示,hsBAFF以剂量依赖的方式刺激B淋巴细胞增殖,明显高于对照组,且hsBAFF+anti-IgM对B细胞的促增殖作用高于hsBAFF单刺激组。hsBAFF呈剂量和时间依赖的增加Erk、Akt、mTOR磷酸化水平,明显下调PP2A蛋白活性。提示:hsBAFF可能通过抑制PP2A活性激活Erk和mTOR信号促进B淋巴细胞增殖。
2、mTOR信号在hsBAFF促进B淋巴细胞增殖中作用研究
采用抗CD-19磁珠分离纯化鼠脾脏B淋巴细胞。分离的B细胞接种到96或6孔培养板,实验设对照组、0.2μg/ml Rap处理组、5μg/ml hsBAFF处理组、hsBAFF+2.5μg/mlanti-IgM共刺激处理组、hsBAFF+Rap处理组、hsBAFF+anti-IgM+Rap处理组。MTT法分析B淋巴细胞增殖。Western blot分析Akt、S6K1和4E-BP1蛋白表达。结果显示,Rap靶向抑制mTOR明显阻滞hsBAFF单独、或和anti-IgM共刺激诱导的B细胞增殖,以及Akt和mTOR介导的S6K1和4E-BP1磷酸化增加。提示:mTOR信号通路在hsBAFF促进B淋巴细胞增殖中发挥重要作用。
3、hsBAFF上调[Ca2+]I介导PP2A-Erk和mTOR信号转导促进B细胞增殖
采用抗CD-19磁珠分离纯化B淋巴细胞。分离的B细胞接种到96或6孔培养板,实验设对照组、20μM BAPTA/AM(或100μM2-ABP)处理组、5μg/ml hsBAFF处理组、hsBAFF+2.5μg/ml anti-IgM共刺激处理组、hsBAFF+BAPTA/AM(或2-ABP)处理组、hsBAFF+anti-IgM+BAPTA/AM(或2-ABP)处理组。MTT法分析BAPTA/AM或2-ABP对hsBAFF诱导B淋巴细胞增殖影响。Western blot分析BAPTA/AM对hsBAFF诱导Erk、mTOR、PP2A、CaMKII磷酸化表达的影响。结果显示,BAPTA/AM或2-ABP预处理明显减弱hsBAFF单刺激或联合anti-IgM共刺激B细胞的增殖;BAPTA/AM抑制hsBAFF激活CaMKII,阻滞hsBAFF触发PP2A去甲基化和磷酸化以及Erk及mTOR信号通路激活。提示:hsBAFF上调[Ca2+]I关联CaMKII磷酸化,可能介导PP2A-ERK和mTOR信号激活促进B细胞增殖。