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研究背景与目的前列腺癌(prostate cancer,PCa)在全球范围内十分常见。探究有效的前腺癌治疗策略,并寻求新的治疗靶点,成为目前前列腺癌的研究热点。随着研究的深入,人们研究关注的视角也逐步由肿瘤细胞本身扩展到肿瘤所在的微环境,试图通过肿瘤细胞所处的周围环境进一步了解或明确肿瘤发生发展的可能机制。巨噬细胞是肿瘤微环境中浸润最丰富的炎症细胞,被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs),分为 M1 型(抗肿瘤)和 M2 型(促肿瘤)。然而,肿瘤细胞中哪些关键性信号分子或信号轴调控了巨噬细胞向肿瘤周围浸润、极化等问题目前仍不清楚。PKCζ参与并调控多种肿瘤的不同细胞内信号通路,是前列腺癌的一个抑癌基因,但PKCζ是否参与调节肿瘤微环境的免疫抑制炎症反应以及进而对肿瘤功能的影响,目前尚不清楚。本研究的主要目的是探讨前列腺癌PKCζ的表达是否可以通过影响前列腺癌微环境巨噬细胞的募集以及极化等生物学功能,从而影响肿瘤的发生发展;同时进一步探究其具体的作用机制,旨在为肿瘤免疫治疗提供新的思路。研究内容与方法1.前列腺癌PKCζ的表达对前列腺肿瘤微环境巨噬细胞的募集和极化的影响1.1免疫组织化学染色分析正常前列腺组织和前列腺癌组织中PKCζ的表达与CD206+ M2巨噬细胞的浸润情况1.2 siPKCζ干扰效果和质粒CA-PKCζ过表达效果的验证Lip3000脂质体转染分为两组:siCTL、siPKCζ;Hilymax转染质粒也分为两组:CON、CA-PKCζ,分别转染PC3和DU145,48 h后分别提取这4组的RNA和蛋白验证mRNA水平和蛋白表达水平。1.3前列腺癌细胞PKCζ的表达对巨噬细胞RAW264.7的趋化迁移的影响干扰或过表达48 h后收集前列腺癌细胞的培养上清(CM)。通过体外细胞趋化募集实验,观察上述各组条件培养基体外趋化巨噬细胞RAW264.7的作用。1.4前列腺癌细胞PKCζ的表达对巨噬细胞RAW264.7向M2型巨噬细胞极化的影响采用体外细胞共培养实验,将巨噬细胞与干扰或过表达PKCζ的前列腺癌细胞进行共培养。1.5 M2巨噬细胞对前列腺癌细胞迁移的影响收集经和未经IL-4(40ng/ml)预处理48 h的巨噬细胞的培养上清,定义为M2-CM和M0-CM,比较两者对前列腺癌细胞的迁移作用。2.前列腺癌PKCζ的表达调控肿瘤相关巨噬细胞趋化和极化相关分子机制2.1巨噬细胞趋化相关细胞因子和极化相关细胞因子的筛选在前列腺癌细胞干扰PKCζ后检测巨噬细胞趋化相关细胞因子和极化相关细胞因子的mRNA水平。2.2进一步明确前列腺癌细胞PKCζ对IL-4和IL-10的表达和分泌的作用,以及对巨噬细胞向M2型极化的影响在前列腺癌细胞系干扰PKCζ后通过RT-QPCR检测1I-4和IL-10的mRNA水平,ELISA检测CM的IL-4和IL-10的蛋白分泌水平。在巨噬细胞siCTL和siPKCζ共培养体系中加入IL-4和(或)IL-10的中和抗体,分为五组:siCTL、siPKCζ、siPKCζ+Ab-IL-4、siPKCζ+Ab-IL-10、siPKCζ+Ab-IL-4+Ab-IL-10。研究结果1.前列腺癌PKCζ的表达抑制前列腺肿瘤微环境巨噬细胞的募集和M2型极化1.1前列腺癌组织标本中PKCζ的表达与肿瘤分级以及CD206+ M2巨噬细胞浸润数量呈负相关关系(P<0.001)。1.2成功验证小干扰RNA-siPKCζ和质粒CA-PKCζ过表达效果1.3敲低前列腺癌细胞PKCζ的表达可促进巨噬细胞RAW264.7的趋化迁移(P<0.05),而过表达PKCζ可以抑制RAW264.7的趋化迁移(P<0.05)。1.4敲低前列腺癌细胞PKCζ的表达可促进巨噬细胞RAW264.7向M2型巨噬细胞极化。M2的标记(CD206,CD163,Arg-1,Mrc-2)的mRNA水平明显高于共培养对照组siCTL(P<0.05)。1.5 M2巨噬细胞促进前列腺癌细胞的迁移(P<0.001)。2.前列腺癌PKCζ的表达负向调控肿瘤相关巨噬细胞募集和极化相关的分子机制2.1巨噬细胞趋化相关细胞因子和极化相关细胞因子的筛选,IL-4和IL-10的表达明显增加。2.2前列腺癌细胞PKCζ负向调控前列腺癌细胞IL-4和IL-10的表达和分泌(P<0.05),进而抑制巨噬细胞向M2型极化。结论1.前列腺癌细胞PKCζ的表达抑制前列腺肿瘤微环境巨噬细胞的募集和M2型极化。2.前列腺癌细胞PKCζ负向调控前列腺癌细胞IL-4和IL-10的表达和分泌,进而抑制巨噬细胞向M2型极化。