论文部分内容阅读
番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）,引起番茄黄化曲叶病。近年来,该病在我国北方大面积发生,严重影响了番茄的产量,已经成为了影响我国番茄生产的首要限制因子。但对于TYLCV的分子变异情况的研究尚不完善,检测体系不够完善而且只停留在定性的水平上,不利于更好的开展关于TYLCV的防治和研究工作。2010-2011年,我们在山东、河南、河北等地的番茄种植区采集了疑似感染TYLCV的样品,利用双生病毒的通用引物和TYLCV的全长引物扩增得到了30个TYLCV的DNA-A全长序列；优化了PCR和荧光定量PCR的检测体系。主要研究结果如下：1.通过与GENBANK中的其他序列进行比较分析,结果表明,TYLCV分离物在北方地区没有明显的重组现象；一致率比较发现,中国中部和东南沿海地区的TYLCV分离物与番茄黄化曲叶病毒以色列株系一致率最高,为98.8%～99.4%；系统进化树表明,北方地区TYLCV分离物属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系,且在进化树上可分为三个组,其中Ⅱ组主要为山东地区分离物,田组主要为河南地区分离物；三个不同省份的TYLCV分离物都呈现出负向选择,核苷酸变异较大；错配分析表明,TYLCV在这三个省处于一种平衡状态；基因交流结果表明,山东和河北地区之间交流最为频繁。2.根据GENBANK上登陆的TYLCV的基因序列设计了三对不同位置的检测引物,通过对Taq DNA聚合酶、退火温度及不同位置引物的灵敏度的优化,得出最佳引物和最优的检测体系：最佳引物为SY1:5’-GTT GAG GAAACT TAC GAG CC-3’; SY2:5’-CAT TCT TCA CTG TTG CGG T-3’,退火温度为55。C,体系为10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL,10mmol/L的上下游引物各1μL, Taq polymerase0.5μL,模板DNA3μL,加重蒸水至25μL。利用该体系在对番茄病样检测中检测到TYLCV。3.根据GENBANK上登陆的TYLCV的基因序列和番茄内源参照基因的序列,设计了SYBR Green法荧光定量PCR目的引物及内参引物,通过PCR和溶解曲线分析,以及对退火温度和引物浓度的优化,最终确定退火温度为58℃,引物浓度为0.2μmol/L。对感病植株不同部位的病毒含量的检测发现：对不同品种的感病植株检测发现,编号为81号的番茄品种对病毒的抗性最差。构建了标准品质粒,通过与普通PCR的灵敏度比较,发现SYBR Green荧光定量PCR比普通PCR灵敏100倍,生成的标准曲线相关性良好,通过对嫁接不同时间的番茄植株病毒含量的变化检测表明,病毒在22-28d内含量迅速增加。