乙型肝炎病毒(HBV)基因组全长仅为3200个碱基，包括4个相互重叠的读框：前C／C基因、P基因、S基因和X基因。依据核苷酸序列异质性≥8％可将HBV毒株分成不同的基因型。到目前为止一共发现了8个HBV基因型：基因型A、B、C、D、E、F、G和H。进一步的研究发现在HBV同一基因型内也存在着较大差异，并根据核苷酸序列异质性≥4％且＜8％划分基因亚型。HBV基因型呈一定的地理区域性分布：A型主要分布于欧洲北部、西部及美国；B、C型主要分布于亚洲；D型是分布最广泛的基因型，是地中海地区和中东的优势基因型，也发现于亚洲少数地区。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带且与基因型D有类似的基因特征，异质性最为明显的F型主要分布于南美及中美洲。HBV几个主要的基因型中均发现基因亚型现象的存在。其中基因型A可分为A1-A3 3个亚型；基因型B可分为B1-B4 4个亚型；基因型C可分为C1-C4 4个亚型；基因型D分为D1-D4 4个亚型；基因型F可分为F1、F2两个亚型。在我国大陆地区流行的HBV基因型有A、B、C、D四种，所占比例分别为1.2％、39.3％、50.2％、8.1％。各地区的HBV基因型分布也大不相同。在北方地区，以基因型C为主，占81.6％；南方则以基因型B为主。序列分析显示我国HBV基因型B毒株均为具有基因型C特征前C／C基因重组体，即属于Ba亚型，尚未发现Bj亚型的证据。近来的研究报道，在基因型内发现亚型存在的现象。其中基因型C已被分为至少4种亚型，在亚洲流行的主要为C1及C2亚型。研究还发现，在C1与C2亚型间可能存在分子生物学及临床病变方面的差异。C基因型是在我国大陆地区流行的最主要基因型之一，本章的目的是在前面已有的基础上，进一步研究基因型C亚型在我国各省的地理分布、分子生物学及临床特点。本研究使用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型以及克隆测序方法，分析了512例HBV基因型C感染者血清。此外，为了鉴定HBV C／D重组体，血清样本首先使用常规PCR-RFLP基因分型方法分型，经限制性内切酶平行酶切，根据图谱初步筛出酶切结果认为基因型D的样本。进一步使用引物扩增非D基因型前S1基因区，直接鉴定出基因型D样本，经筛选后的样本则进行全基因序列扩增，进行序列比较鉴定HBVC／D重组体。另外，从研究的样本中随机选取基因型C1，基因基因型C2，HBV／C／D重组体进行全基因序列测定。然后将本研究中所得HBV／C全基因序列与来自GenBank中HBV全序列一起构建全基因进化树。此外，为分析在本研究中新发现的一种基因型C与D重组后的亚型特点，将S基因另作进化树分析。所有数据均使用统计软件包SPSS13.0进行分析。均数比较使用两独立样本t检验，率的比较使用x~2检验或Fisher’s确切概率法。P≦0.05，差异有统计学意义。结果发现HBV／C1、HBV／C2是中国地区最普遍的HBV／C亚型，其中是HBV／C1占71％(393／512)，HBV／C2占27％(112／512)此外，在对全国血清样本进行基因分型的过程中，我们任意选取PCR—RFLP分型鉴定的基因型B、C、D样本各3份进行了全序列的测定以判断该分型方法的准确性。结果发现，以PCR—RFLP分型鉴定为基因型D的部分样本测序后比较证实为基因型C，后来的研究显示该种毒株在S区与基因型D相同，暂时命名为HBVC／D重组体。并根据其序列特征建立了该重组体的初步筛选方法。以初步筛选方法对来自甘肃的HBV血清样本进行了分析，发现了7例该种重组体；选取其中部分样本进行HBV全基因序列的测定，测序结果证实重组的存在。这种亚型均为HBV基因型C与基因D毒株的重组体。因此，在中国大陆地区至少存在3种HBV／C基因亚型：HBV／C1、HBV／C2、及HBV／C／D。如同基因型呈地域性分布的特点一样，基因型C亚型在我国不同地区的分布也有很大差异。在北方地区，98％以上基因型C毒株均属于C2亚型，C1亚型罕见；而在南方地区，55％基因型C毒株为C1亚型，C2占较小比例。HBVC1亚型与C2亚型在各省的分布情况为：北京2％(1／54)与98％(53／54)；山东1％(1／100)与99％(99／100)；云南13％(5／38)与87％(33／38)；湖南19％(3／16)与81％(13／16)；广东63％(47／75)与37％(28／75)；海南79％(53／67)与21％(14／67)。在东南地区的福建省，C1与C2的亚型的比例分别为1％(1／72)与99％(71／72)。在中国西部HBV慢性感染人群中，基因型C亚型的情况与其它地区不同。在甘肃地区，C亚型的分布比例：C1为1％(1／90)，C2为91％(82／90)，C／D重组体为8％(7／90)。本研究中还比较了两种主要C基因亚型C1与C2感染者之间的临床差异。人口学资料比较发现，C1亚型感染者年龄较C2亚型感染者小(31.6±12.4vs.34.4±12.0，p=0.03)。尽管C1亚型感染者较C2亚型感染者有较高的HBeAg阳性率，两者之间并无统计学差异。两组病例在性别比率、肝功能检查(ALT水平及总胆红素水平)及临床诊断方面未见统计学差异。因此，HBV基因亚型存在的现象对于疾病发生发展的影响尚有待进一步研究。在本研究的第二部分，为研究HBV基因型功能学的差异，使用了腺病毒载体将目的HBV基因导入真核细胞，对不同HBV基因型毒株的表达与复制进行了比较研究。腺病毒(Adenovirus，Ad)分布广泛，在许多哺乳动物和禽类中都发现其存在。其中人的腺病毒有50种以上，但通常都较温和，很少危及生命。腺病毒对于研究真核细胞DNA的复制、转录，RNA剪接加工，蛋白质的合成以及细胞转化做出过重要的贡献。腺病毒还具有高滴度、高稳定性、高转染效率、非致癌性等特点。此外，对野生型腺病毒进行基因工程改造而制作的重组病毒载体系统，作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体也得到了广泛应用。本研究运用了一种新的重组病毒构建方法AdEasyTM系统，在体外模型中研究不同基因型HBV病毒复制活性差异。首先，我们构建了1.3拷贝HBV／B、HBV／C全基因组，在其5’末端包含增强子Ⅰ及增强子Ⅱ，复制起点，X及前C启动子基因，前基因RNA转录起始位点，特异多腺苷酸化位点以及完整的X开放读框。这种结构已被证明能在肝脏细胞及转基因小鼠中进行有效的复制。随后，将1.3拷贝HBV全基因插入到重组病毒穿梭载体pAdTrack的多克隆位点中，该位点位于CMV启动子及绿色荧光蛋白(GFP)位点上游，利用该系统，一方面可通过表达的GFP在荧光显微镜下观察重组病毒感染情况，另一方面，构建的1.3拷贝HBV全基因能够利用病毒自身的调控序列启动HBV的复制，避免了载体上的外源启动子对HBV复制及表达的影响。将重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体pAdeasy-1共转化E.coli BJ5183细菌使之内重组。在细菌中发生同源重组后，选出重组质粒并酶切鉴定，将鉴定出的重组质粒经PacⅠ线性化后使用脂质体介导转染293细胞，通过GFP可以监测转染效率和病毒的产生。得到重组腺病毒之后，进行纯化和扩增，再使用两种不同基因型HBV重组腺病毒感染HeDG2细胞。使用ELISA法检测细胞及培养上清中的HBsAg及HBeAg的表达情况，用美国雅培公司的化学发光全自动免疫分析仪对细胞及培养上清中的HBsAg及HBeAg进行检测并进行定量分析；荧光定量法检测细胞及培养上清中HBV的滴度：免疫组化检测细胞内HBsAg及HBcAg的表达情况。结果表明，从我国慢性乙肝病毒感染者血清中获得的HBV基因型B和C毒株，并经过全序列的测定确定其基因型。通过酶切与连接成功构建了两种基因型的1.3拷贝HBV DNA，克隆筛选后进行序列测定，证实了两种基因型1.3拷贝HBVDNA序列正确无误。为确保所构建的有复制能力的1.3拷贝HBV DNA在病毒复制过程中不受这些重要位点的影响，对测序结果进行仔细核对，并与多株参考序列进行比对，排除了有插入、缺失及重要位点突变的克隆。1.3拷贝HBV DNA序列经双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，与腺病毒穿梭载体pAdTrack进行连接，连接物转化JM109细菌，随机挑取克隆，双酶切法初步验证插入序列片段大小的正确性。重组穿梭载体再用YS1-YS2进PCR扩增后，NdeⅠ内切酶消化，验证插入序列基因型的正确性。两种基因型的重组穿梭载体分别被命名为AdTrack-HBV-B和AdTrack-HBV-C；转化感染受态细菌Adeasier-1感受态细胞得到两种基因型的腺病毒重组体：pAdeasier-B和padeasier-C，PacⅠ酶切鉴定其正确性。大量提取的重组腺病毒质粒pAdeasier-B和pAdeasier-C用PacⅠ酶切线性化后，用脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染293细胞转染7-10天后，即可在荧光显微镜下看见明显的GFP荧光，随着培养时间的延长，荧光斑点数也随之增多，在普通显微镜下可见明显的病毒蚀斑，293细胞也出现固缩、变圆、脱落、裂解等明显的细胞病变现象，结果证明了重组病毒的形成和扩增。收获转染10天后的293细胞及上清液，反复冻融裂解后，再重新感染293细胞。感染2天后细胞即可看到GFP的表达，细胞也出现变圆、脱落、裂解等明显的细胞病变现象。收获二次感染的细胞及上清液，反复冻融裂解后，取上清再次感染293细胞，进行病毒的大量扩增，使两种基因型的重组腺病毒滴度约为10~9／ml。研究表明，两种重组病毒的包装是成功的，并且均具有很高的滴度，能够有效的感染293细胞，并有很强的GFP表达。按感染复数为5的标准，两种基因型的腺病毒重组体分别感染HepG2细胞。当感染细胞培养至第5天时收集感染细胞及上清，细胞内HBcAg及HBsAg经免疫组织化学法检测，均有蛋白表达。细胞及上清中的HBeAg和HBsAg用ELISA法进行检测，结果可明确检测到HBeAg及HBsAg的表达；上清及细胞内病毒颗粒经定量检测后有明确的上升，说明我们所构建的1.3拷贝HBV DNA能够在HepG2细胞内进行表达和复制。分别用两种不同HBV基因型的重组腺病毒感染HepG2细胞，以后隔日收集感染细胞及清，并分别对上清中的病毒颗粒、HBeAg及HBsAg进行定性及定量检测。感染第2天时，上清中即可检测到病毒颗粒、HBeAg及HBsAg。感染第4天时上清中HBeAg及HBsAg的表达量最高，以后随着细胞培养时间的延长，HBeAg及HBsAg的表达量呈下降趋势，HBeAg及HBsAg的表达量C基因型明显高于B基因型。上清中病毒颗粒的量在第2天时即达最高值，然后随培养时间的延长呈缓慢下降趋势，但两种基因型间病毒定量无差别。在本研究中，我们证明了腺病毒载体能够将具有复制能力的HBV基因转导入肝细胞系，并能启动HBV复制导致完整的具有感染能力的HBV颗粒的产生，这说明导入的HBV DNA能在被转染的细胞中复制。腺病毒介导的HBV转染成功将为我们进一步研究病毒在细胞内的复制能力，比较不同的病毒株复制能力的差异，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新的可靠途径。本研究利用新型腺病毒系统在HBV基因型体外功能学研究方面的进行了初步尝试。研究结果证明，腺病毒系统能作为HBV体外功能学研究和毒株之间比较研究的非常有效的工具。研究的初步结果显示，B基因型和C基因型在体外复制过程中其抗原表达有差异，基因型C明显高于基因型B，但病毒复制水平未见明显差异。由于本研究只是比较了两种基因型之间单一毒株的差异，这种初步结果有待进一步更深入的研究加以证实。