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目的:探讨小乌桂汤对胶原诱导性关节炎小鼠(Collagen-induced arthritis mice,CIA)免疫细胞的调节作用及机制。方法:1小乌桂汤对CIA小鼠MDSCs、Th17、Treg细胞的调节作用研究1.1 CIA小鼠模型的构建及分组建立CIA小鼠模型,于首次免疫后第28天按关节指数评分(Arthritic index score,AI)随机分成模型组(Model group,MO)、甲氨蝶呤组(Methotrexate group,MT),小乌桂汤低剂量组(Xiao Wu Gui Decoction Low-dose group,XL)、小乌桂汤中剂量组(Xiao Wu Gui Decoction Medium-dose group,XM)、小乌桂汤高剂量组(Xiao Wu Gui Decoction High-dose group,XH),另设正常对照组(Normal Control group,NC),每组8只。XL、XM、XH组分别予小乌桂汤19.5 g生药/kg/d、39g 生药/kg/d、75 g 生药/kg/d;MT 组予甲氨蝶呤 2mg/kg/w;NC、MO组给予等剂量的蒸馏水1次/d,药液均按0.2 mL/10g的量灌胃,连续给药28天。1.2小乌桂汤对CIA小鼠MDSCs、Th17、Treg免疫细胞的调节作用实验过程中,称量小鼠体重;评定AI评分;千分尺测量小鼠足厚度。取材后,测定脾脏指数(Spleen Index,SI);流式细胞术检测外周血MDSCs和脾脏MDSCs及Th17、Treg细胞的比例,并进行MDSCs、Th17、Treg细胞比例与AI评分的相关性分析以及MDSCs与Th17、Treg细胞比例的相关性分析;流式多因子检测技术检测血浆TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-10的表达水平;HE染色评估踝关节的病理变化;免疫组化染色评估踝关节TNF-α、IL-1β、IL-17、Foxp3的表达水平。2小乌桂汤冻干粉对小鼠骨髓细胞分化为MDSCs、DC、巨噬细胞的调节作用研究2.1 CCK8法测定小乌桂汤对小鼠骨髓细胞以及GM-CSF诱导的小鼠骨髓细胞活力的影响2.1.1 小乌桂汤冻干粉(Xiao Wu Gui Decoction Lyophilized Powder,XWG)对小鼠骨髓细胞活力的影响:小鼠骨髓细胞接种于96孔板上,每孔4000个细胞,分为 7 组:NC 组、0.25 mg/mL XWG 组、0.5 mg/mL XWG 组、1 mg/mL XWG组、1.25mg/mLXWG 组、2.5mg/mLXWG 组、5mg/mLXWG 组,另设空白孔,每组设置5个复孔,培养96 h后,采用CCK8法检测细胞活力。2.1.2小乌桂汤冻干粉对GM-CSF诱导的小鼠骨髓细胞活力的影响:小鼠骨髓细胞接种于96孔板上,每孔4000个细胞,分为8组:NC组、GM-CSF组、0.25mg/mLXWG 组、0.5mg/mLXWG 组、1mg/mLXWG 组、1.25mg/mL XWG组、2.5mg/mLXWG组、5mg/mLXWG组,另设空白孔,每组设置5个复孔,培养96 h后,采用CCK8法检测细胞活力。2.2小乌桂汤冻干粉对小鼠骨髓细胞分化为MDSCs、DC、巨噬细胞的调节作用2.2.1小乌桂汤冻干粉对小鼠骨髓细胞分化为MDSCs、DC、巨噬细胞的影响:小鼠骨髓细胞接种于24孔板上,每孔10000个细胞,分为5组:NC组、GM-CSF 组、0.25 mg/mLXWG 组、0.5 mg/mLXWG 组、1mg/mLXWG 组,培养96 h,流式细胞术检测MDSCs、DC、巨噬细胞的比例。2.2.2小乌桂汤冻干粉对小鼠骨髓细胞STAT3、MAPK、NF-κB信号通路的影响:小鼠骨髓细胞接种于细胞培养皿,每孔107个细胞,分为3组:NC组、GM-CSF组、1 mg/mL XWG组,培养30分钟,Western Blot检测小鼠骨髓细胞STAT3、JNK、ERK、p38MAPK、NF-κBp65 磷酸化蛋白的表达水平。结果:1小乌桂汤对CIA小鼠MDSCs、Th17、Treg细胞的调节作用研究1.1与MO组小鼠相比,XM、XH组小鼠AI评分、发病足肿胀程度显著降低(p<0.05);XL、XM、XH 组 SI 均显著降低(p<0.01)。1.2与MO组小鼠相比,XM、XH组小鼠外周血G-MDSC水平均显著升高(p<0.05),M-MDSC水平均显著降低(p<0.01);XL、XM、XH组小鼠脾脏中G-MDSC水平均显著升高(p<0.05),M-MDSC水平均显著降低(p<0.05);XM、XH组小鼠Th17细胞水平均显著降低(p<0.01,p<0.01),Treg细胞水平均显著升高(p<0.01,p<0.01)。1.3 CIA小鼠外周血M-MDSC 比例与AI评分呈正相关(r=0.4008,p=0.0104),脾脏M-MDSC 比例与AI评分成正相关(r=0.4304,p=0.0056),脾脏MDSCs、G-MDSC 比例与 AI 评分呈负相关(r=-0.4915,p=0.0013)(r=-0.3838,p=0.0145)。CIA小鼠脾脏Th17细胞比例与AI评分呈正相关(r=0.4092,p<0.0087),Treg细胞比例与AI评分呈负相关(r=-0.2732,p=0.0080)。CIA小鼠外周血M-MDSC比例与Th17细胞比例成正相关(r=0.675,p<0.0001),G-MDSC 比例与Treg细胞比例呈正相关(r=0.3604,p=0.0223)。CIA小鼠脾脏M-MDSC 比例与Th17细胞比例呈正相关(r=0.4626,p=0.0026),MDSCs、G-MDSC 比例与Th17的比例呈负相关(r=-0.364,p<0.0209)(r=-0.6055,p<0.0001)。1.4与MO组小鼠相比,XL、XM、XH组小鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17的表达水平均降低,IL-10表达水平无显著差异。1.5与MO组小鼠相比,XM、XH组小鼠踝关节病理总评分、血管翳评分、骨破坏评分均显著降低(p<0.05),XH组小鼠踝关节滑膜炎评分显著降低(p<0.01)。XL、XM、XH组小鼠踝关节TNF-α、IL-1β、IL-17的表达水平均显著降低(p<0.05),Foxp3的表达水平均显著升高(p<0.05)。2小乌桂汤冻干粉对小鼠骨髓细胞分化为MDSCs、DC、巨噬细胞的调节作用研究2.1小乌桂汤冻干粉浓度为0.25、0.5 mg/mL时,干预小鼠骨髓细胞96 h,活力显著高于NC组(p<0.01,p<0.01),浓度1 mg/mL时,细胞活力与NC组相当。2.2小乌桂汤冻干粉浓度为0.25、0.5 mg/mL,干预GM-CSF诱导的小鼠骨髓细胞96h,活力显著高于NC组(p<0.01,p<0.01),浓度为1mg/mL时,细胞活力与NC组相当。2.3小乌桂汤冻干粉干预GM-CSF诱导的小鼠骨髓细胞96小时后,与GM-CSF组相比,小乌桂汤冻干粉各组G-MDSC的比例均显著升高(p<0.01),M-MDSC的比例均显著降低(p<0.01),DC的比例均显著降低(p<0.01),巨噬细胞的比例与GM-CSF组无显著差异。2.4小乌桂汤冻干粉干预GM-CSF诱导的小鼠骨髓细胞30 min后,与GM-CSF组相比,小乌桂汤冻干粉组STAT3、ERK、JNK、p38MAPK磷酸化蛋白相对表达量均显著降低(p<0.05,p<0.01,p<0.05,p<0.01)。各组NF-κBp65磷酸化蛋白相对表达量无显著差异。结论:1小乌桂汤具有降低CIA小鼠AI评分、减轻足肿胀、降低SI、抑制踝关节的病理损伤的作用。2 MDSCs、Th17、Treg细胞与CIA小鼠关节炎的严重程度相关,M-MDSC、Th17细胞可能具有促炎作用,G-MDSC、Treg细胞可能具有抑炎作用,MDSCs亚群与Th17、Treg细胞可能存在相互作用,M-MDSC可能促进Th17细胞的分化,G-MDSC可能促进Treg细胞的分化。3小乌桂汤具有调节MDSCs亚群、Th17/Treg细胞平衡的作用,升高G-MDSC、Treg细胞的水平,降低M-MDSC、Th17细胞的水平,促进MDSCs亚群与Th17、Treg细胞相互作用,从而改善CIA小鼠的关节炎。4小乌桂汤抑制促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17的表达,促进抑炎因子Foxp3的表达,从而改善CIA小鼠的关节炎。5小乌桂汤冻干粉对小鼠骨髓细胞分化具有调节作用,促进G-MDSC的分化,抑制M-MDSC、DC的分化,可能与抑制STAT3、MAPK信号通路相关。