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啤酒花（Humulus lupulus L.）是啤酒酿造工业重要的原料，其雌花基部腺毛中的苦味酸能够为啤酒提供特有苦味。根据结构不同苦味酸分为具有三个异戊烯基、两个羟基的β-苦味酸和具有两个异戊烯基、三个羟基的α-苦味酸，其中α-苦味酸是啤酒特有苦味的主要来源。目前，β-苦味酸生物合成途径已解析清楚，α-苦味酸生物合成最后一步羟基化反应尚未报道。 由脱氧α-苦味酸生成α-苦味酸的反应是羟基化反应，而羟基化主要是由单加氧酶催化完成的。由于α-苦味酸在啤酒花腺毛中特异积累，且其前体物质脱氧α-苦味酸在叶绿体膜上合成的。因此我们推测催化α-苦味酸生成的单加氧酶在腺毛中特异并高量表达，且在叶绿体膜或周边定位。 通过检索啤酒花腺毛特异的EST文库，我们发现共有19个候选单加氧酶(Mooxygenase，MO)基因，分别命名为Hl1MO～Hl19MO。分析候选单加氧酶基因转录本的组织特异性，发现共有8个单加氧酶在腺毛中特异表达。亚细胞定位分析发现除Hl18MO在叶绿体上定位外，其他单加氧酶均定位在内质网上。通过3RACE，5RACE及大量cDNA克隆测序，发现Hl18MO在啤酒花中共有5个转录本。预测开放阅读框，发现Hl18MO有两个完整的编码序列:Hl18MO-N和Hl18MO-14。亚细胞定位确定两个序列编码的蛋白均位于叶绿体周边。因此Hl18MO可能是催化脱氧α-苦味酸羟基化的酶。 用InterProScan对H118MO一级蛋白结构进行分析，发现H118MO N端有一个GxGxxG基序，属于黄素依赖单加氧酶。进一步聚类分析发现H118MO属于E类黄素依赖单加氧酶，而与在植物中发现的其他属于B类的黄素依赖单加氧酶不能聚到一起。 为进一步明确H118MO的生化功能，我们分别将Hl18MO两个转录本、以拟南芥密码子优化后的Hl18MOAt(Arabidopsis codon-optimized H118MO，H118MOAt)与α-苦味酸合成通路上其他基因HlCCL2(Carboxylate CoA ligase，CCL)，HlCCL4，HlVP(Valerophenone synthase，VPS)及拟南芥密码子优化后的异戊烯基转移酶(Prenyltransferase，PT)PT1At，PT2At在酵母DD104中共表达后分析苦味酸衍生物生成情况，结果发现脱氧α-苦味酸产量略有降低，但并没有检测到α-苦味酸的产生。说明H118MO单独表达不能够催化脱氧α-苦味酸的羟基化反应，反应可能需要电子传递蛋白的参与。 我们进一步在啤酒花腺毛特异的EST库中检索得到两类单加氧酶电子传递蛋白:细胞色素P450还原酶CPR(Cytochrome P450 reductase，CPR)、铁氧化还原蛋白Fd(Ferredoxin，Fd)和铁氧化还原蛋白还原酶FDR(Ferredoxin reductase，FDR)。其中1个H1CPR（即4MO），4个H1Fd和3个H1FDR。为促进电子传递蛋白与H118MO间电子传递的高效进行，将H118MO与4个Fd，3个FDR进行不同的组合后融合，并与合成通路上游基因在酵母DD104中共同表达，并没有检测到α-苦味酸的产生。说明Fd-FDR类电子传递蛋白不能够促进H118MO的单加氧酶活性。将不同形式的H118MO（全长、去除N端前27个氨基酸及去除N端前40个氨基酸）与不同形式CPR（啤酒花本身CPR、酵母CPR及拟南芥ATR2）进行融合后在酵母中共表达，发现以拟南芥密码子优化后的H118MO与拟南芥ATR2融合的组合(Arabidopsis-codonoptimized H118MO and ATR2 fusion，AAR)能够检测到α-苦味酸的生成。 酵母双杂交实验表明，苦味酸合成途径中胞质定位各蛋白间无相互作用。泛素介导的膜蛋白酵母双杂交实验表明，PT1与H118MO有明显的相互作用，PT2与H118MO有微弱相互作用，暗示啤酒花中参与α-苦味酸合成的蛋白通过形成复合体来促进其高效合成。 综上所述，我们的研究不仅明确了啤酒花腺毛中负责α-苦味酸合成最后一步羟基化反应的酶（编码基因）及其反应机理，证明高效生成α-苦味酸酶复合体的存在;同时也为利用合成生物学策略创制高效合成α-苦味酸的酵母菌株奠定了基础。