背景心脏是推动血液循环的动力器官,起着泵血的作用。心脏传导系统是由特殊分化的心肌细胞构成,产生并维持心脏正常的节律,保证心房、心室收缩和舒张的协调。心脏传导系统包括窦房结、结间束、房室结、希氏束、束支、蒲肯野纤维。心脏兴奋的正常传导依赖于整个传导系统的完整性。高度房室传导阻滞是心脏内外科多种疾病的常见并发症,比如缺血性心脏病及外科手术中房室结的损伤。1958年置入第一台全埋置式心脏起搏器,自此,人工心脏起搏成为高度房室传导阻滞的唯一治疗方法。近50年来,随着科学技术的不断进步,人工心脏起搏在工程技术方面都取得了长足进展,临床适应症不断拓宽,因此需要心脏起搏治疗的患者也越来越多。但是大量临床资料也已证实心脏起搏器的并发症甚多：1、与植入手术有关的并发症：心律失常、气胸和血气胸、囊袋出血、误穿锁骨下动脉和误置电极导线于左心室等。2、与组织损伤和炎症反应有关的并发症：囊袋伤口破裂、囊袋皮肤坏死和囊袋感染(严重者可致败血症)等。3、与电极导线有关的并发症：心肌穿孔、导线损坏、静脉血栓形成、心肌外肌肉收缩、输出阻滞和电极移位等。4、与起搏器有关的并发症：起搏器感知障碍、心动过速和起搏综合症等。5、起搏器电池寿命导致再次手术的可能、对于体格发育中的患者也有明显局限性。此外,安装起搏器的患者须避免进入有强电磁场的环境,不得接受电热治疗、微波治疗或中、高频治疗等,一些日用电器如电热毯、电动剃须刀的使用也受到限制,给患者的日常生活带来极大不便。由于起搏器存在的种种缺陷,人们期待一种更加安全可靠的替代疗法的出现。随着分子生物学的发展,人们试图发展生物起搏器。目前心脏生物起搏的研发策略主要是基因治疗,而基因治疗要成功地实施,必须具备三个关键因素：针对性的治疗基因；基因运送系统；基因表达调节系统。但是,相对于生物化学和分子生物学等学科对基因治疗技术的巨大促进作用,进展缓慢的基因运送系统已经严重制约着基因治疗的发展。虽然组织工程学在人工心脏瓣膜和血管的研究也都取得了重大进展,但对于房室传导阻滞的组织工程治疗研究,国外还处于起步阶段,国内也没有相关报道。2006年,美国波士顿儿童医院Choi YH等从胎鼠体内获得成肌细胞,并培养、接种到胶原质骨架结构,之后将其植入实验鼠房室沟内,试图用它来连接心房与心室间的信号传导。实验结果显示,这一培养组织可以很好地传导电脉冲信号,而且这种传导是永久性的。但同时实验也存在一些问题：1.由于实验鼠心脏太小,不能有效破坏房室结,影响了对经培养组织下传电信号的观察；2.由于心房和植入组织之间的局部传入阻滞,须额外低电流刺激才能观察电信号传导,而这个问题在大型动物模型中是可以避免的；3.虽然电脉冲信号能够下传,但培养组织并不能像正常房室结一样对信号进行延搁,所以导致了心房心室同时除极,影响了正常心脏功能。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells MSCs)存在于骨髓基质,具有多向分化潜能。它可以向多种结缔组织和一部分来源于外胚层的组织分化,比如脂肪、软骨、骨、肌肉、真皮、神经等。骨髓间充质干细胞取材方便,在体外培养时具有黏附性,成纤维样生长,且表达特定的细胞表型,如CD29, CD44, CD90, CD105,而不表达CD34,CD45,因此易于鉴定和纯化。骨髓间充质干细胞可分化为多系细胞,来源比较充足,无免疫抗原特性,体外培养成活率较高,目前已成为心脏病细胞治疗最有潜力的种子细胞。缝隙连接又称通讯连接,包括代谢偶联和电偶联,广泛分布于动物组织细胞间,偶联细胞相互通讯。缝隙连接是紧密连接的特定区域,连接两个细胞膜,一个细胞膜上的结构被称为连接子,又叫半通道,是由六个亚单位—连接蛋白(connexin, Cx)分子构成的6聚体蛋白质。Cx普遍存在于心脏的工作细胞和传导系统的特化细胞中,只是在数量与分布形式上存在着差异,不同的心肌组织表达不同表型的Cx,形成具有特定的生物学特性的细胞间通道。在哺乳动物心脏上发现了不少于4种Cx的存在,心房肌细胞表达Cx43、Cx40、和Cx45,心室肌细胞表达Cx43和Cx45,各项研究表明Cx43是心室肌细胞间电流的主要导体。Maze手术的实践证明,适当设计成形的心房肌条可以用来充当心房—心室电信号传导的介质。因此,我们设计将右心耳翻转与右心室做吻合,以期望心房细胞和心室细胞间建立起缝隙连接,为增加连接面积,减少心电传导的电阻,我们在心房心室吻合面之间注入体外培养的骨髓间充质干细胞,以求达到心电更好的传导。第一部分：骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定及标记研究目的：研究骨髓间充质干细胞的分离、体外的培养、鉴定并观察生物学活性,探讨4’,6二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)对于骨髓间充质干细胞标记效果。研究方法：1.骨髓间充质干细胞的分离、体外的培养、鉴定Histopaque密度梯度离心法从三月龄狗的髂骨骨髓血中分离出含有杂细胞的骨髓间充质干细胞,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution PBS)洗两到三次,细胞种植到T75cm2塑料培养瓶中,培养瓶中为含有10%胎牛血清,青霉素(100μg/ml),链霉素(100μg/ml)的低糖DMEM培养液,在含5%CO2及95%湿度的37℃细胞培养箱中继续培养3天,培养细胞更换培养液,利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性,黏附细胞可继续生长,未贴壁细胞则被抛弃。约10-15天培养后,黏附的细胞可呈集落式生长,达到70%-90%的融合。0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,按1：2-3比例传代(104/cm2)。观察骨髓间充质干细胞形态,生长速度并绘制骨髓间充质干细胞的生长曲线。骨髓间充质干细胞的表面抗原检测：0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,PBS洗三次,洗掉残留培养液以去除干扰,制备成106个/m1的细胞悬液100μ1,加入相应抗体20u1,避光、室温反应30min,1500rpm,室温离心10min。再次加入500μ1PBS重悬细胞,流式细胞仪检测细胞CD29, CD44, CD34。犬IgG-FITC作为同型对照。2.骨髓间充质干细胞体外DAPI标记在含有第三代骨髓间充质干细胞的塑料培养瓶中加入4’,6二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI),使得DAPI最终浓度为50μg/ml,在含5%CO2及95%湿度的37℃细胞培养箱中孵育30min,移去培养液,PBS冲洗4次,尽量洗掉细胞外DAPI,荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞体外DAPI标记效果。结果：使用Histopaque密度梯度离心法结合贴壁筛选法可得到较高纯度的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞通过体外培养扩增,培养5-7天可见MSCs呈集落聚集性生长,集落中央的细胞最为密集。呈现典型的梭形状,并呈旋窝状排列。生长曲线显示1-5天为潜伏期,7天以后则进入快速生长期,传代后的MSCs增值速度较原代培养细胞加快,第三代骨髓间充质干细胞已基本得到纯化。但是随着传代的增多,骨髓间充质干细胞增殖能力逐渐减弱,克隆形成率逐渐在降低。流式细胞仪细胞表面抗原检测CD34阴性,超过95%细胞表达CD29, CD44,符合骨髓间充质干细胞的特征。第三代骨髓间充质干细胞体外DAPI标记阳性率达到100%。结论：Histopaque密度梯度离心法结合贴壁筛选法可得到较高纯度的髓间充质干细胞,DAPI可有效标记骨髓间充质干细胞的胞核。第二部分：骨髓间充质干细胞辅助右心耳右心室吻合建立新的电传导通路的实验研究研究目的：翻转犬右心耳与右心室吻合建立新的电信号传导的通路,吻合面注入骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells MSCs)以达到减少电阻的目的,使心室易于起搏,并探讨其可能机制。研究方法：1岁龄雄性比格犬24只,体重12-15kg,随机分为三组,每组8只,分别为对照组,DMEM培养液组,MSCs组。制备右心耳翻转与右心室吻合动物模型,对照组仅给予右心耳翻转与右心室吻合；DMEM培养液组在吻合面注入0.3mlDMEM培养液;MSCs组在吻合面注入0.3mlDMEM培养液混悬DAPI标记的MSCs (1×108/ml).制备动物模型前,比格犬行心脏彩超检查,了解左心室射血分数(left ventricular ejection fraction LVEF),动物麻醉后左侧第四肋间进胸,给予右心耳翻转与右心室吻合处理,吻合面积约1cm2。8周后再次行心脏彩超检查对比术前、术后心脏功能有无明显变化；动物麻醉后循原切口进胸,切断右心耳,仅保留右心耳与右心室呈岛状连接,体外心脏起搏器刺激残留心耳,并记录右心室是否可有起搏及起搏电流的大小；留取吻合面周围心肌组织行缝隙连接蛋白43(connexin43)及心肌肌钙蛋白T (Cardiac Troponin T)免疫荧光双染色检测,了解MSCs在吻合面内向心肌细胞的转化效果。结果：右心耳翻转与右心室吻合动物模型制备前平均左室射血分数83.2±1.9%,8周后复查心脏彩超显示平均左室射血分数为82.5±2.2%,术前、术后LVEF无明显变化(P=0.09)。电子起搏器心室起搏实验中,对照组共有7只可成功起搏,平均起搏电流17.1±1.2mA, DMEM培养液组共有6只起搏,平均起搏电流17.8±1.2mA, MSCs组8只全部起搏,平均起搏电流10.8±0.7mA, MSCs组起搏电流较DMEM培养液组和对照组明显降低(P<0.01),DMEM培养液组和对照组起搏电流则无明显区别(P=0.25)。免疫荧光双染色可见右心房心室吻合面内仍有DAPI阳性的MSCs细胞,且该细胞同时表达心肌特异性的肌钙蛋白T(Cardiac Troponin T)和参与电机械偶联的缝隙连接蛋白43(connexin43)。结论：右心耳翻转与右心室吻合可建立电信号传导的有效介质,吻合面内注入的MSCs可转化成具有电信号传导功能的心肌细胞,并可明显减少电阻,降低最小起搏电流。