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小胶质细胞激活诱发的神经炎症及神经元损伤在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)等神经退行性疾病病理生理机制中发挥了重要作用。过渡金属离子,特别是具有氧化还原活性的Cu2+,对于维持中枢神经系统的生理生化功能起着重要的作用。脑内Cu2+浓度过高或过低均可能导致神经元损伤。有证据显示,神经退行性疾病患者或者动物模型脑内细胞内外Cu2+分布不平衡,细胞外Cu2+浓度升高,远远超出正常生理浓度,而细胞内Cu2+浓度降低;过高浓度的细胞外Cu2+可直接损伤神经元,但是否能够直接激活与神经元密切接触的小胶质细胞,尚无文献报道。基于此,本课题拟对Cu2+直接作用于小胶质细胞后,其功能状态的改变及其分子机制进行较深入探讨。 本研究采用原代培养的大鼠小胶质细胞以及小鼠BV-2细胞株,应用ELISA、Greiss法和WST-1试剂测定小胶质细胞培养上清中的肿瘤坏死因子-α( Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide,NO)以及超氧化物(superoxide)含量;应用Amplex Red试剂测定小胶质细胞培养上清或分离线粒体组织中过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)的含量;应用能够特异性检测活细胞线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的荧光探针,检测线粒体内ROS含量;应用Western blot检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、IκB-α表达以及Akt、胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase1/2, ERK1/2)磷酸化水平。 研究结果显示:1)Cu2+处理12 h后,小胶质细胞呈现明显的激活状态;Cu2+(5-50μM)能够剂量依赖性地诱导小胶质细胞释放TNF-α和NO,并诱导iNOS表达;2)IκB-α和IKK-2阻断剂能够显著抑制Cu2+诱导的TNF-α产生;Cu2+作用12h后小胶质细胞内IкB-α表达明显下降(为NF-кB激活标志之一),提示Cu2+激活小胶质细胞的作用为NF-кB依赖性;3)在激活小胶质细胞剂量下,Cu2+对原代海马神经元没有明显毒性,但其处理小胶质细胞后获得的条件培养液能够明显降低神经元活力;4)Cu2+处理后小胶质细胞培养上清中H2O2含量明显增加(该作用在Cu2+处理后5 min即可产生);烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)阻断剂Apocynin(100μM)和Diphenyleneidonium(DPI,10μM)预处理对该作用没有明显影响;Cu2+处理后小胶质细胞培养上清中超氧化物水平没有明显变化;Cu2+能够促进分离的线粒体组织释放H2O2(该作用同样在Cu2+处理后5 min即可产生),以及活细胞线粒体内ROS产生。提示ROS(以H2O2的形式)可能参与了Cu2+诱发小胶质细胞激活作用,而且该H2O2的来源可能为线粒体,而非NOX;5) NOX阻断剂Apocynin(100μM)和DPI(10μM)预处理不影响Cu2+诱导的TNF-α释放,进一步提示NOX可能不参与Cu2+激活小胶质细胞作用;6)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)阻断剂LY294002(25μM)和ERK1/2阻断剂U0126(10μM)预处理能够显著抑制Cu2+诱导的TNF-α释放,而蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)阻断剂对此没有阻断作用;Western blot结果显示Cu2+作用于小胶质细胞后,ERK1/2和Akt磷酸化水平明显升高。提示PI3K/Akt和ERK1/2信号均参与了Cu2+激活小胶质细胞作用;7)应用LY294002预处理后,再应用Cu2+处理小胶质细胞,ERK1/2磷酸化水平不再升高,提示在功能上PI3K/Akt信号可能位于ERK1/2信号上游;8)LY294002和U0126均能够抑制Cu2+诱导的H2O2释放,提示PI3K/Akt-ERK1/2信号通路可能介导了H2O2的产生。 综上,本研究通过一系列细胞学实验初步证实了:1)亚神经毒性剂量下Cu2+能够直接激活小胶质细胞,诱导NF-кB活化,促进TNF-α和NO等炎症因子的产生,并由此导致间接神经元毒性;该作用可能不依赖于NOX。2)亚神经毒性剂量下Cu2+能够迅速诱发小胶质细胞释放胞外H2O2,其来源可能为线粒体,而非NOX。3)PI3K/Akt-ERK1/2信号通路在Cu2+激活小胶质细胞作用中可能发挥了重要作用,该信号可能介导了H2O2的产生。本研究结果为阐明神经退行性疾病早期的金属离子相关神经炎症机制提供了重要实验依据。