论文部分内容阅读
目的:
1.以大鼠肺组织为研究对象,建立一种简单、可靠、重复性好的肿移植动物实验模型,模拟肺移植过程中肺组织热缺血损伤以及缺血再灌注损伤过程。
2.应用免疫组化和分子生物学技术,研究肺组织热缺血损伤以及缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白3(AQP3)的表达及其功能,以及药物对其影响；探讨其表达与肺移植后肺损伤的关系,进一步阐明肺移植过程中肺热缺血损伤以及缺血再灌注损伤的发生机制；为今后临床调控水通道治疗肺移植后肺损伤提供科学的理论与实验依据。
方法：
1.大鼠肺组织缺血再灌注损伤动物模型的建立以及肺组织水通道蛋白的检测。
将40只大鼠随机分为供体组和受体组,每组20只。供体组再随机分为2组,每组10只,分别为LPD灌注组与LPD+金纳多组；受体组也随机分为2组,每组10只。获取供体组大鼠左肺为实验组,应用受体组大鼠建立离体肺缺血再灌注模型。A组即LPD灌注组,供体大鼠左肺经肺动脉灌注LPD液后于4℃保存8小时,然后将受体鼠静脉血经左侧股静脉插管引出并灌注供体肺,供肺氧合后的动脉血经左侧股动脉回输受体鼠.循环灌注1小时,供体右肺为对照组,即B组；C组即LPD+金纳多组,供体肺缺血前15分钟经静脉给予金纳多20mg/kg,余处理同LPD组,供体右肺为对照组,设为D组。造模成功后,取A、B、C、D四组肺组织；应用免疫组化法、免疫印迹法、RT-PCR法检测肺组织AQP1,AQP3蛋白和mRNA的表达。
2.大鼠肺组织热缺血损伤动物模型的建立以及肺组织水通道蛋白的检测。
将30只SD大鼠随机分为A组:热缺血时间0小时(n=10); B组:热缺血时间1小时(n=10)；C组:热缺血时间2小时(n=10).。大鼠用1％戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg),无需气管插管。沿前正中线剪开胸骨及腹壁,离断腹主动脉放血至心跳停跳。处死后,A组:取左肺,立即用LPD液灌注；B组:室温下放置60min,不进行任何处理,再灌注肺保护液；C组:室温下放置120min,不进行任何出理,再灌注肺保护液。造模成功后,切取部分肺组织,免疫组化法、免疫印迹法、RT-PCR法检测肺组织AQP1,AQP3蛋白和mRNA的表达。
结果：
1.建立离体大鼠肺组织缺血再灌注损伤动物模型,进行模拟肺移植后,灌注流量稳定可调,移植肺气体交换好,能够模拟肺移植的循环过程。
2.离体肺缺血再灌注损伤后肺组织水通道蛋白的检测:
AQP1表达在肺组织血管内皮细胞,AQP3表达在细支气管上皮细胞、肺泡Ⅱ型细胞和粘膜下腺分泌细胞。AQP1在A组,以及B组肺组织中的mRNA表达平均相对A值分别为0.30±0.08、0.63±0.10,差异有统计学意义(P<0.05),AQP3分别为0.49±0.09、0.85±0.06,差异有统计学意义(P<0.05)；AQP1在C组,以及D组肺组织中的mRNA表达平均相对A值分别为0.49±0.11、0.68±0.12,差异有统计学意义(P<0.05),AQP3分别为0.73±0.12、0.91±0.13,差异有统计学意义(P<0.05):比较AQP1和AQP3在A组与C组肺组织中的mRNA表达平均相对A值差异也有统计学意义(P<0.05)。
在A组以及B组肺组织中AQP1蛋白表达的相对灰度值分别为0.65±0.06、1.13±0.18,差异有统计学意义(P<0.05)。AQP3蛋白分别为0.52±0.11、1.92±0.26,差异有统计学意义(P<0.05)；在C组以及D组肺组织中AQP1蛋白表达的相对灰度值分别为0.88±0.11、1.25±0.21,差异有统计学意义(P<0.05),AQP3分别为0.96±0.18、1.89±0.32,差异有统计学意义(P<0.05)；比较AQP1和AQP3在A组与C组肺组织中蛋白表达的相对灰度值,差异也有统计学意义(P<0.05)。
3.肺热缺血损伤后肺组织水通道蛋白的检测:
AQP1在热缺血时间0小时,1小时和2小时组的肺组织中的mRNA表达平均相对A值分别为0.63±0.10、0.49±0.07、0.36±0.06,差异有统计学意义(P<0.05),AQP3分别为0.85±0.06、0.76±0.08、0.52±0.07,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹分析结果显示:B组C组肺组织AQP1和AQP3蛋白含量显著下降,在热缺血时间0小时,1小时和2小时组的肺组织中AQP1蛋白表达的相对灰度值分别为1.13±0.18、0.88±0.13、0.76±0.09,差异有统计学意义(P<0.05)。AQP3蛋白分别为1.92±0.26、0.95±0.15、0.61±0.07,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：
1.离体大鼠肺组织缺血再灌注损伤动物模型以及肺组织热缺血损伤动物模型具有操作简单、可靠、经济的特点,为研究肺移植过程中不同阶段肺损伤的机制提供了良好的平台。
2.大鼠肺组织有AQP1及AQP3的表达。AQP1主要表达在肺组织血管内皮细胞,AQP3表达在细支气管上皮细胞、肺泡Ⅱ型细胞和粘膜下腺分泌细胞。
3.大鼠肺组织缺血再灌注损伤后,AQP1,AQP3表达下调,提示缺血再灌注损伤可能与AQP1,AQP3表达下调有关；缺血前应用金纳多可使AQP1,AQP3表达下调程度减弱。提示金纳多可能通过调控水通道表达水平减轻肺移植后缺血再灌注损伤。
4.热缺血损伤过程中,AQP1,AQP3表达明显下调,且热缺血损伤时间不同,AQP1,AQP3表达下调程度有显著性差异,提示肺移植过程中热缺血损伤产生机制可能与AQP1,AQP3表达下调有关,随着热缺血时间的延长,AQP1,AQP3表达下调程度逐渐增加。