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研究背景及目的糖尿病是一种全球性疾病,国际糖尿病联盟数据显示,糖尿病的患病率在全世界范围呈上升趋势,目前患病率是8.8%,中国糖尿病患者人数为1.09亿人,居全球首位,并且增长速度非常快。大约有三分之一的病人发展成糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN ),DN属于一种微血管病变,是造成患者死亡、残疾的原因之一,也是终末期肾病的主要原因。因而进一步研究糖尿病肾病的发生发展机制,寻求新的治疗靶点和治疗策略显得尤为重要。DN的发病机制尚不明确,高血糖、高血脂、高血压等多种因素参与糖尿病肾病的发生与发展,这些因素诱导多种炎性介质分泌,促进炎性细胞聚集导致DN出现免疫损伤,因此免疫系统激活和微炎症状态是目前较一致认可的DN发病机制。正五聚蛋白3 (PTX3)是一种与C-反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAP)同属于正五聚蛋白超家族的急性炎症蛋白,由多种炎症免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞、树突样细胞和内皮细胞等分泌或合成。CRP和SAP属于短链正五聚蛋白,而PTX3属于长链正五聚蛋白,在多种炎症相关性疾病如微生物感染、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化等发挥着重要作用,它能够通过模式识别、激活补体等机制发挥调理素和调节炎症的功能。在急慢性感染性疾病中,PTX3和CRP可以作为标志物在血液中很快升高,在一些无菌性炎症中,它的水平可以更直接的反映血管炎症状态。最近,一些临床研究表明,升高的血浆PTX3水平与心血管疾病和慢性肾脏病(CKD)有关。PTX3水平与体重指数(BMI)呈负相关表明PTX3可能在肥胖和代谢综合征中起到一定作用。最近,AbuSemanN等研究表明,血浆PTX3水平的降低与2型糖尿病和糖尿病肾病有关。然而,目前的研究只集中在内源性PTX-3水平表达的升高或是沉默与其他疾病的关系,对于PTX3治疗作用的研究却不多,只有零星的研究发现,PTX3能有效预防巨细胞病毒感染,减少肺部曲霉菌感染,降低脓毒血症小鼠模型的病死率等。在急性心肌梗动物模型中具有保护心脏的作用,可能与PTX3有抗动脉粥样硬化有关。Lech M等研究发现,内源性或外源性PTX3能够减轻小鼠缺血再灌注后的急慢性肾损伤。基于上述背景,本研究第一部分探讨PTX3是否具有减轻糖尿病肾病的肾损伤作用。材料与方法1.糖尿病肾病(DN)模型的建立24只8-12周龄雄性C57BL/6小鼠,6只正常饲养小鼠为正常对照组(NC组)。18只小鼠腹腔注射链脲佐菌素STZ (50mg/kg)连续5天,定期检测血糖和尿蛋白。STZ注射4周后经化验证实DN小鼠模型建模成功,进行干预分组,分为三组,PTX3组(n=6),DN小鼠建模成功后腹腔注射Recombinant PTX3 (0.5 mg/kg),每日一次,共注射4周;Anti-PTX3组(n=6),为中和内源性PTX3,建模成功后腹腔注射抗鼠PTX3单克隆抗体(anti-mouse PTX3 mAb,0.2 mg/kg)每日一次,共注射4周;Control组(n=6)为糖尿病肾病小鼠对照组,腹腔注射同等剂量的缓冲液;干预4周(即STZ给药8周)后处死所有小鼠,药物干预前(STZ给药4周)和干预后(STZ给药8周)分别留取血样检测血肌酐和24小时尿液,测定小鼠尿微量白蛋白的水平。Western blot检测正常对照组(NC组)和DN小鼠Control组肾组织内足细胞标记物Desmin和Nephrin的蛋白表达水平。2. PTX3能够减轻糖尿病肾病的肾损伤18 只 DN 小鼠分为三组,PTX3 组(n=6), Anti-PTX3 组(n=6)和 Control组(n=6 ),用免疫组化法检测Desmin在三组小鼠肾组织中的表达,Western blot检测三组肾组织Nephrin和WT-1的蛋白水平。应用流式细胞术(FCM)检测三组肾组织中炎性细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Ly6G+中性粒细胞和CD11b+巨噬细胞的数目。Western blot检测三组肾组织炎症因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表达水平。结果1. STZ注射4周后糖尿病肾病模型组(Control组)血糖和尿微量白蛋白水平明显高于正常对照组(NC组)(P<0.05),Control组足细胞损伤标记物Desmin蛋白表达水平显著高于NC组,而正常足细胞标记物Nephrin的蛋白水平显著低于NC组(P<0.05),说明糖尿病肾病小鼠模型成功建立。2.通过对DN小鼠三组(PTX3组、Anti-PTX3组、Control组)实验结果的比较发现,PTX3干预糖尿病肾病小鼠4周后,尿微量白蛋白定量明显低于干预前(P<0.05),在同期对照比较中,PTX3组尿微量白蛋白定量明显低于Control组(P<0.05); Desmin在PTX3组小鼠肾组织中的表达减少,Nephrin和WT-1的蛋白水平显著高于Control组(P<0.05),而Anti-PTX3组则显示出相反的结果,加重了 DN的肾损伤。3. PTX3组肾组织中浸润的炎性细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Ly6G+中性粒细胞和CD11b+巨噬细胞的数目明显少于Control组(P<0.05),PTX3能够上调抑炎性因子IL-4和IL-13,下调促炎性因子IFN-γ、TNF-α的表达(P<0.05),说明PTX3能够抑制促炎性免疫反应。结论1. PTX3可以降低STZ诱导的糖尿病肾病小鼠尿微量白蛋白定量,具有稳定足细胞结构、减少足细胞损伤的作用,从而减轻糖尿病肾病的肾损伤。2.PTX3能够减少糖尿病肾病小鼠肾组织中炎性细胞浸润,上调抑炎性因子IL-4和IL-13,下调促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α的表达,减轻肾组织的炎性损伤。研究背景及目的糖尿病肾病的发病机制尚不明确,高血糖、高血脂、高血压等多种因素参与糖尿病肾病的发生与发展,这些因素诱导多种炎性介质分泌,促进炎性细胞聚集导致DN出现免疫损伤。因此多种炎症因子和免疫细胞参与DN的免疫损伤,这是目前一致认可的DN发病机制。DN早期,巨噬细胞作为最主要的炎性细胞浸润在肾小球和肾间质中,由于具有极强的异质性,能够在不同环境诱导下分化为不同表型的亚群,从而发挥不同的功能。Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α可以刺激巨噬细胞向M1型分化(经典活化型),M1主要表达iNOS、CD16/32、IL-12及TNF-a等促炎因子,主要发挥抗原提呈和免疫炎症作用。Th2分泌IL-4和IL-13可以诱导巨噬细胞向M2型分化(替代活化型),M2高表达CD206、Arg-1及IL-10等分子,表现为抗炎活性,有很强的组织修复能力。临床及动物实验均显示在糖尿病组织损伤部位存在以M1型巨噬细胞为主。在一定条件下,M1和M2亚型可相互转换。我们第一部分实验结果显示PTX3能够减少活性炎性细胞的浸润,下调促炎性因子IFN-γ、TNF-α和上调抑炎性因子IL-4和IL-13的表达,从而减少肾脏促炎性免疫反应,减轻糖尿病肾病的肾损伤。而IL-4和1L-13可以诱导巨噬细胞向M2型分化,推测PTX3可能具有调节巨噬细胞M1/M2动态平衡,促进巨噬细胞向M2型分化,减少炎症损伤的功能。因此本研究第二部分通过体内和体外实验研究PTX3是否能够抑制M1型巨噬细胞表达,促进巨噬细胞向M2型转化,进一步说明PTX3通过促进M2型巨噬细胞的分化减轻糖尿病肾病的肾损伤。材料与方法1.为研究PTX3是否影响巨噬细胞的极化作用,分别从DN小鼠模型和体外RAW264.7细胞培养进行研究。利用本研究第一部分中三组DN小鼠(Control组、PTX3组和Anti-PTX3组)的肾脏取材标本,Western blot检测M1型巨噬细胞表型标记物iNOS、CD16/32和M2型巨噬细胞表型标记物CD206、Arg-1蛋白水平的变化,流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测M1型和M2型巨噬细胞的数目。2.小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7用RPMI 1640培养基培养,含10%FBS、青霉素100u/mL和链霉素100u/mL。采用高糖(右旋葡萄糖)浓度依赖性(11.1mM,20mM,30mM,35mM)以及时间依赖性(0h,6h,12h,24h,48h)剌激RAW264.7细胞株。用酶活性法检测巨噬细胞活化表型标志物iNOS的活性。Recombinant PTX3 (200ng/ml)干预高糖(30mM)组 RAW264.7 细胞,预孵育 12小时,Trizol法提取细胞RNA,采用RT-PCR技术检测M1型巨噬细胞表型标记物iNOS、CD16/32和M2型巨噬细胞表型标记物CD206、Arg-1 mRNA的变化。结果1.与DN小鼠Control组相比,M1型巨噬细胞表型标记物iNOS、CD16/32的蛋白水平在PTX3组中表达明显增多而M2型标记物CD206、Arg-1蛋白水平则显著减少(P<0.05),通过流式细胞术检测M1型和M2型巨噬细胞的数目发现,PTX3组M2型巨噬细胞的数目明显多于M1型(P<0.05),而Anti-PTX3组则显示出相反的结果,说明PTX3可以促使DN小鼠肾组织的巨噬细胞由M1型向M2型转化。2.高糖环境下能够刺激RAW264.7的iNOS活性增强,呈浓度依赖性上升。其中,30mM高糖组刺激RAW264.7表达iNOS活性达最大值(48.1±6.6 U/mgprot,P<0.05)。高糖时间依赖性刺激RAW264.7,高糖组从0至12h产生iNOS活性随时间延长表达逐渐增加,呈时间依赖性。高糖刺激RAW264.7达12h时iNOS活性达最大值(44.6±10.7U/mgrot,P<0.05)。高糖(30mM,121h)刺激M1型标记物iNOS、CD16/32 mRNA 表达增加(P<0.05),M2 型标记物 CD206、Arg-1 mRNA表达下降(P<0.05)。高糖(30mM)+ PTX3干预后,M1型标记物iNOS、CD16/32 mRNA 表达下降(P<0.05),M2 型标记物 CD206、Arg-1 mRNA 表达增加(P<0.05),说明高糖环境可以促使巨噬细胞向M1型活化,PTX3可以促使高糖环境下的RAW264.7细胞由M1型向M2型转化。结论1. PTX3在体内和体外实验中均促使巨噬细胞由M1型向M2型转化,达到减轻糖尿病肾病的肾损伤作用。2.高糖促进RAW264.7细胞以时间和浓度依赖性表达iNOS活力,促使巨噬细胞向M1型转化。