随着医学的发展,产前诊断成为人们关注的焦点。目前产前诊断的方法有有创伤性和无创伤性两种,有创伤性的产前诊断方法主要有羊膜腔穿刺、绒毛膜取样、脐带取血,该诊断方法具有创伤性,易造成胎盘出血,流产等并发症；无创伤性产前诊断主要是利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行的诊断,因其不会对胎母造成一定的危害,因此无创伤性的产前诊断越来越受到重视。新生儿溶血病作为产前诊断的常规检测项目之一,是由于胎母血型不合引起的溶血性疾病,携带有不同于母体血型抗原的胎儿红细胞经胎盘出血进入母体,刺激母体产生相应的免疫抗体,这些抗体通过胎盘屏障作用于胎儿,使胎儿红细胞出现不同程度的溶血,因此可以通过胎母血型预测新生儿溶血病。新生儿溶血病主要发生ABO和RH血型系统。目前国外己将无创伤性产前诊断胎儿血型应用在RH血型系统中,而ABO血型系统尚未应用。本研究主要是建立ABO和RH血型系统无创伤性产前胎儿血型基因诊断的方法,能够为临床新生儿溶血病的诊断提供信息,具有一定的创新性和临床意义。本研究分为三个部分。在第一部分试验中,我们比较了五种不同的血浆DNA的抽提方法并对孕妇血浆中胎儿DNA含量做了检测,同时还研究了胎儿DNA的标志性分子。五种抽提方法中以QIAamp DSP Virus Kit和天根TGuide病毒基因组DNA提取试剂盒(OSR-M211)抽提效果最好,且两者抽提效率基本相同；天根TGuide病毒基因组DNA提取试剂盒(OSR-M211)为自动抽提试剂盒,省时省力省钱,因此天根TGuide病毒基因组DNA提取试剂盒(OSR-M211)是一种更为经济有效的提取血浆中游离胎儿DNA方式。本研究采用这种经济有效的方法对孕妇血浆中胎儿DNA含量进行了检测,同一孕妇不同孕周外周血血浆中游离胎儿DNA的含量随着孕周的增大而增高,但具有一定的波动性；同一孕周不同孕妇外周血血浆中游离胎儿DNA的含量相差很大,具有较大个体差异性。孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量低、片段小,易造成假阴性,为避免假阴性,本研究使用RASSF1A基因作为胎儿的标志性分子。母源性的RASSF1A基因的启动子为低甲基化的,而胎源性RASSF1A基因的启动子为高甲基化的,经甲基化敏感的限制性内切酶BstU1消化后母源性的RASSF1A基因完全被消化而胎源性不受影响；胎源和母源的β-actin均为低甲基化的,均能被BstU1消化,因此RASSF1A基因是否完全被消化以β-actin的消化完全与否来监测。研究结果显示100U的BstU1在60℃16小时条件下能将35ul的血浆DNA中的母源性DNA消化完全。本研究探究了限制性内切酶的消化对胎儿DNA的影响,研究发现消化后检测到的胎儿DNA含量明显低于消化前检测到的胎儿DNA含量说明消化可能对胎儿DNA造成了一定的损伤。第二部分是孕妇血浆中胎儿RH血型的基因诊断。首先是通过血清学和分子生物学的方法筛选RHD-的孕妇,然后采用两重定量PCR (real-time PCR)(探针法)对103例RHD-的孕妇血浆标本进行扩增,根据扩增结果判断胎儿的RHD血型,并使用脐带血验证预判结果的准确性。结果显示我们预判准确率为95.2%。本研究所采用的孕妇血浆中胎儿RHD血型的基因诊断方法是可行的,能够准确的预判RHD-的孕妇的胎儿的RHD表型。第三部分是孕妇血浆中胎儿ABO血型的基因诊断。首先血清学筛选O型孕妇,针对ABO血型基因的特点,设计位点特异性引物(sequence specific primer, SSP),通过定量PCR (SYBR Green染料法)的方法检测O型孕妇血浆中的A或者B基因,根据检测结果预判胎儿血型,最终将预判结果与脐带血血清学结果进行比对,验证本方法的敏感性和特异性。本方法最终确认AB引物的检测非O模板灵敏度为3.3pg/ul,B引物检测B基因的灵敏度为6.6pg/ul。本实验中对92例O型孕妇血浆标本进行了检测,脐带血的验证结果显示,对于大月份(大于23孕周)样本,定量PCR检测B基因的特异性为100%,准确度为100%；定量PCR检测A基因的特异性和准确性为74.1%,不能100%区分A基因和O基因,27例预判为A型的个体脐带血发现5例为O型,2例为B型；另外由于检测B基因和非O基因的定量PCR的检测灵敏度都不是很高,导致O血型预判的假阴性,因此本实验中对于低浓度的样本未能正确分型。综上所述,我们建立的无创伤性产前胎儿RhD和ABO血型诊断的方法,能够为临床新生儿溶血病的诊断提供重要信息,为无创伤性诊断胎儿血型应用于临床提供了重要参考资料。