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肿瘤细胞可借助多种信号通路逃避化疗药物诱导的细胞凋亡,显著减弱单靶点化疗药物的治疗效果。化疗药物和基因的联合用药可同时作用于肿瘤细胞内不同的信号通路,克服单靶点治疗缺陷,有效提高抗肿瘤功效。但化疗药物选择性差、毒副作用大,基因药物稳定性差、细胞摄取效率低,均需借助合适的递送载体以提高体内功效。壳聚糖及其衍生物生物相容,生物可降解,无免疫原性,且易于根据实际需要进行多种功能修饰,己广泛用作化疗药物或基因的递送载体。本课题组前期制备的亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖(LMC)在水中可自组装形成纳米粒,已分别用于难溶性抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)和模式质粒增强型绿色荧光蛋白表达质粒(EGFP)的高效递送。本课题拟借助LMC的亲水修饰、疏水修饰以及可进行配体修饰的特点,共载抗肿瘤药物和基因联合给药以协同增强其抗肿瘤功效。合成亚油酸和聚苹果酸不同接枝比的LMC纳米粒,叶酸(FA)修饰以提高其主动靶向能力。选择PTX和survivin shRNA表达质粒(iSur-pDNA),分别作为模型抗肿瘤药物和基因,共载制备LMC/PTX/pDNA纳米复合物,考察亲水修饰、疏水修饰以及FA修饰对纳米复合物体内外抗肿瘤功效的影响。LMC/PTX/pDNA纳米复合物的粒径为151-220 nm, Zeta电势为41-46 mV；粒径随亚油酸接枝比的增大而减小,随聚苹果酸接枝比的增大而增大。包封率测定结果表明纳米复合物中PTX和iSur-pDNA的包封率均高于80%,增大亚油酸接枝比、减小聚苹果酸接枝比以及FA修饰均可增加LMC/PTX/pDNA纳米复合物的PTX包封率。核酶抑制试验结果表明LMC纳米粒可有效保护iSur-pDNA免遭核酶降解。以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白考察纳米复合物的抗蛋白吸附作用,结果表明LMC/PTX/pDNA纳米复合物的蛋白吸附量随亚油酸和聚苹果酸接枝比的增大及FA修饰而减少。考察QGY-7703人肝癌细胞和L02人正常肝细胞对LMC/PTX/pDNA纳米复合物的摄取效率,结果表明二种细胞的摄取效率均随亚油酸接枝比的增大而提高,随聚苹果酸接枝比的增大而降低,FA修饰可显著提高QGY-7703细胞的摄取效率。QGY-7703细胞摄取机制研究结果表明LMC/PTX/pDNA纳米复合物主要经能量、脂筏依赖的网格蛋白途径入胞,与小窝蛋白介导的内吞、细胞骨架重构和巨胞饮均无关。体外释放试验结果表明亚油酸和聚苹果酸接枝比增大以及FA修饰均可降低PTX释放速率,增加iSur-pDNA体外释放。核质分布试验结果表明90%以上的PTX分布于细胞质,有助于与其作用靶点微管蛋白结合；iSur-pDNA在细胞核中的分布随亚油酸接枝比的增大而增加,随聚苹果酸接枝比的增大而减少,FA修饰可增加iSur-pDNA在细胞核中分布。QGY-7703细胞体外转染试验结果表明LMC/PTX/pDNA纳米复合物的体外转染效率随亚油酸接枝比的增大而提高,随聚苹果酸接枝比的增大而降低,FA修饰可提高转染效率。肿瘤细胞凋亡和体外细胞存活率试验结果表明LMC/PTX/pDNA纳米复合物的肿瘤细胞杀伤率随亚油酸接枝比的增大而增大,随聚苹果酸接枝比的增大而减小,FA修饰可进一步增强肿瘤细胞杀伤。考察LMC/PTX/pDNA纳米复合物体内抗肿瘤功效,结果表明FA修饰的LMC/PTX/pDNA纳米复合物可协同增强PTX和iSur-pDNA的抗肿瘤作用,延长荷瘤小鼠生存期;与FA-LMC3/PTX/pGL或FA-LMC3/pDNA组相比,FA-LMC3/PTX/pDNA纳米复合物组的抗肿瘤作用最强,荷瘤小鼠生存期最长,与肿瘤细胞凋亡和体外细胞存活率试验结果吻合；与FA-LMC3/PTX/pGL纳米复合物组相比,LMC3/PTX/pDNA纳米复合物组的抑瘤率和生存期显著增加,表明PTX和iSur-pDNA联合给药靶向多靶点较FA介导的主动靶向抗肿瘤功效增强更为显著。综上所述,两亲性聚合物纳米粒-叶酸修饰的亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖纳米粒可作为抗肿瘤药物和基因的共载载体,协同增强化疗药物和基因的抗肿瘤功效。