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特发性肺纤维化是一种病因不明,临床缺乏有效治疗,死亡率高的肺间质性疾病。目前认为呈成纤维细胞/肌成纤维细胞聚集灶的形成是IPF的重要的病理特征,而肌成纤维细胞是主要的效应细胞,目前研究认为肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化是肌成纤维细胞的主要来源之一。因此深入研究上皮间质转化（EMT）意义重大。近期研究发现ECM大量堆积不但是肺纤维化发病时多因素共同作用的最终结果,反过来异常的ECM也影响肺纤维化进程,两者互为因果,恶性循环。去细胞支架是通过即运用酶和化学去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）、Triton-X100等方法去除脏器实质细胞及可溶性蛋白成分,保留形态与超微结构完整的不溶性ECM。近期研究发现3D肺纤维化去细胞支架与成纤维细胞共同培养后,成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,但3D肺纤维化去细胞支架对体外培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞的表型调控的作用少见报道,本研究将通过制备正常和肺纤维化的去细胞支架,建立去细胞支架与肺泡Ⅱ型上皮细胞共同培养体系,研究肺纤维化去细胞支架对肺泡Ⅱ型上皮细胞表型调控的作用及可能的机制。第一部分肺去细胞支架的制备目的:应用TritonX-100、SDS肺动脉灌注法制备较为理想的肺脏去细胞支架。方法:取健康雄性大鼠肺脏,使用TritonX-100、SDS灌注法经肺动脉灌注制备肺去细胞支架,对获取的肺脏支架进行大体观、HE、Masson染色、电镜检查、铸型评价去细胞支架的形态;通过支架DNA含量检测明确去细胞支架去细胞程度;通过免疫荧光染色检测胶原蛋白Ⅰ及紧密连接蛋白检测去细胞支架成分的完整性;通过对其生物力学的检测,了解支架的生物力学情况;通过与细胞培养检测去细胞支架对细胞活性的影响。结果:1.肺去细胞支架大体观发现去细胞组肺在灌注过程中逐渐由外至内变白,且逐渐变半透明,灌注完毕全肺变为乳白色半透明状;2.HE染色、masson染色及电镜检测、铸型发现去细胞支架未见细胞核成分,且细胞外基质结构完整连续;3.去细胞肺支架DNA含量极低<50ng/ml;4.免疫荧光染色发现肺去细胞支架成分完整;5.肺去细胞支架与A549共同培养,A549活性良好。结论:本研究获得的肺脏去细胞支架去细胞程度可,且形态、成分、力学方面保持良好。第二部分肺纤维化动物模型制备及3D肺纤维化去细胞支架对肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化的作用研究目的:研究3D肺纤维化去细胞支架对肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化的作用。方法:制备博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型,通过HE染色、masson染色明确纤维化情况。分别制备正常组和纤维化组去细胞生物支架。原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞,建立去细胞支架与肺泡Ⅱ型上皮细胞共同培养体系,分为5组:无支架组,2D正常支架组,2D肺纤维化去细胞支架组,3D正常支架组,3D肺纤维化去细胞支架组;通过免疫荧光染色、免疫印迹和real-time PCR检测各组ATII的E-cadherin、α-SMA的蛋白和mRNA的表达。结果:1.成功制备博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型;2.免疫荧光染色、免疫印迹和real-time PCR提示较正常支架组、2D肺纤维化去细胞支架组相比,3D组的肺泡Ⅱ型上皮细胞的E-cadherin蛋白和基因表达下调、α-SMA蛋白和基因表达上调。结论:1.2D正常及纤维化肺去细胞支架对肺泡Ⅱ型上皮细胞无明显EMT作用;2.3D正常及纤维化肺去细胞支架均可诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT作用,其中以3D肺纤维化去细胞支架作用最为显著;3.肺纤维化后,肺泡上皮细胞所处ECM组织成分及其三维空间微环境结构发生改变,可能是促进肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT,进而加重肺纤维化的原因之一。第三部分整合素β1在肺纤维化去细胞支架促肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT中的作用研究目的:研究整合素β1在肺纤维化去细胞支架促肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT中的作用。方法:对正常和纤维化支架通过免疫印迹和real-time PCR检测整合素β1的蛋白和mRNA的表达。细胞实验分为3组:1.正常对照组2.3D肺纤维化去细胞支架组3.整合素β1受体阻滞组。通过免疫荧光、WB和RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA蛋白和基因的表达。结果:1.与3D肺纤维化去细胞支架组相比,整合素β1受体阻滞组其E-cadherin蛋白和基因表达升高。2.与3D肺纤维化去细胞支架组相比,整合素β1受体阻滞组α-SMA蛋白和基因的表达下降。结论:整合素β1可能介导肺纤维化去细胞支架促肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT中的作用。