脊髓损伤是中枢神经系统严重的创伤性疾病,预后差,致残率高,一旦发生会给患者及家庭带来严重的心理和经济负担。继发性脊髓损伤诱导形成的胶质瘢痕是损伤后期神经功能恢复和轴突再生的主要障碍。巨噬细胞作为继发性损伤中最主要的炎症细胞,其在损伤后大量浸润损伤区域并极化为具有细胞毒性的M1型,诱导炎性反应加重。同时炎症反应进一步激活星形胶质细胞增生活化,分泌以硫酸软骨素(CSPG)为主的细胞外基质,形成阻碍轴突再生的物理及化学屏障。大量研究采用多种治疗方法减少脊髓损伤后胶质瘢痕的形成,如药物治疗、细胞移植、材料移植等,但是这些方法存在着药物安全窗较窄、免疫排斥反应、对人体二次损伤以及作用范围不确切等不足,仍需探寻新的安全有效的治疗方法。弱激光治疗主要是指利用低功率的激光和生物组织相互作用,其具有无创、抑炎、镇痛、促修复等优点,近年来被广泛应用于关节疾病、周围神经损伤、医学美容等治疗中。大量研究表明,810nm弱激光治疗可显著改善脊髓损伤动物的运动功能,促进神经元存活,缩小损伤区空洞面积,减少M1型巨噬细胞的数量,抑制损伤区炎性因子的表达。但弱激光对脊髓损伤后星形胶质细胞具有何种影响,是否能影响星形胶质细胞的活化和分泌,而巨噬细胞在弱激光调控星形胶质细胞中是否发挥着作用,这些问题尚不明确。针对以上的问题,本实验进行如下两部分的研究。实验一:弱激光治疗对脊髓损伤后星形胶质细胞和CSPG的影响目的:研究弱激光治疗对脊髓损伤后星形胶质细胞和CSPG的影响方法:将40只小鼠按照随机数法随机分配到脊髓损伤组和脊髓损伤后弱激光治疗组。弱激光治疗采用810nm弱激光对小鼠脊髓损伤区经皮照射,激光波长810nm,照射功率为150mW,光斑面积0.3cm~2,每天1次,连续照射7天或14天。采用免疫荧光染色方法对脊髓损伤后7天的巨噬细胞、14天后胶质瘢痕及神经轴突的情况进行检测。结果:与脊髓损伤组相比,弱激光治疗后,M1型巨噬细胞的标志物iNOS的表达明显降低,星形胶质细胞的标志物GFAP和CSPG的表达明显下调,伴随着星形胶质细胞的形态和分布的变化,同时,神经轴突再生明显增多,轴突生长距离增加。结论:弱激光治疗能显著抑制脊髓损伤后星形胶质细胞的活化和CSPG的表达,促进轴突再生。实验二:弱激光作用下M1型巨噬细胞对星形胶质细胞的影响目的:探究弱激光作用下M1型巨噬细胞对星形胶质细胞的影响方法:实验采用体外M1型巨噬细胞—星形胶质细胞共培养模型。将星形胶质细胞分为五组:Ctrl组(空白对照);M1组(M1条件培养基培养星形胶质细胞);M1+L组(M1条件培养基培养后进行弱激光照射);L-M1组(弱激光照射M1后的条件培养基培养星形胶质细胞);L-M1+L组(弱激光照射M1后的条件培养基培养星形胶质细胞,同时进行弱激光照射)。弱激光照射参数为:波长810nm,功率密度2mW/cm~2、光斑面积4.5cm~2,照射时长440s。采用免疫荧光和Western Blot检测体外巨噬细胞极化改变,采用RT-qPCR,Western Blot,CCK8检测星形胶质细胞的活化状态,采用RT-qPCR、ELISA方法检测星形胶质细胞的炎性因子(IL-1β、TNF-α)和CSPG核心蛋白(neurocan、NG2、aggrecan)的表达。结果:CCK8检测发现,M1条件培养基增加星形胶质细胞的活性,而弱激光干预后,三组(M1+L、L-M1、L-M1+L)活性明显降低。Western Blot检测发现,与Ctrl组相比,M1显著促进星形胶质细胞GFAP和经典活化通路pSTAT3的表达,与M1组相比,L-M1组和L-M1+L组GFAP和pSTAT3的表达显著抑制。RT-qPCR和ELISA检测发现,相较于Ctrl组,M1组星形胶质细胞neurocan、NG2、aggrecan及炎症因子(IL-1β和TNF-α)的表达显著增加;与M1组相比,L-M1组和L-M1+L组CSPG和炎症因子在基因和蛋白层面的表达均减少,差异具有统计学意义。同时组内比较发现,M1+L组星形胶质细胞的多项表达变化均不如L-M1组和L-M1+L组明显。采用不同组星形胶质细胞制备条件培养基培养原代巨噬细胞,结果发现,M1-astrocyte组星形胶质细胞促进巨噬细胞iNOS的表达,而弱激光干预后,iNOS表达降低。结论:弱激光可显著抑制M1型巨噬细胞诱导的星形胶质细胞活化,减少星形胶质细胞CSPG及炎症因子的分泌;同时星形胶质细胞和巨噬细胞存在着正反馈的交互作用,而在弱激光干预下,两者可向着抑制炎症反应的方向发生变化。