论文部分内容阅读
哺乳动物卵母细胞成熟和着床前胚胎发育对子代遗传物质的传递和后代的繁殖具有重要的意义。研究发现，NEK5和PTHLH在有丝分裂过程中发挥重要的作用，本文对NEK5和PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用及作用机制进行探讨。
本研究主要开展的工作和结果如下：
（1）NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究
本文对NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程中的表达、定位和功能进行研究。通过Western blotting检测NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达情况，NEK5在GⅤ~MⅡ期均有表达，在GⅤ期的表达水平最高。将体外转录获得的Myc-Nek5mRNA以400ng/μl的浓度注射到GV期卵母细胞中，通过用anti-Myc抗体进行免疫荧光染色检测NEK5的定位。结果显示，NEK5在GⅤ期定位于细胞质中，在GVBD期定位于染色体周围，在Pro-MⅠ~MⅡ期定位在纺锤体上。为了研究NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的作用，将Nek5siRNA（small interfering RNA）注射到GⅤ期卵母细胞中以敲降Nek5的表达。研究结果显示，Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞的GVBD率降低，CDK1的活性降低，卵母细胞减数分裂恢复失败，但不影响CDC25B易位到卵母细胞的生发泡。进一步研究发现，Wee1B的敲降和cyclin B1的过表达可以挽救Nek5敲降导致的卵母细胞的减数分裂恢复失败，但Cdc25的过表达不能挽救Nek5敲降导致的卵母细胞的减数分裂恢复失败。也对NEK5在卵母细胞减数分裂中/后期转换中的作用进行研究。研究结果显示，Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞减数分裂第一极体排出率降低，使卵母细胞被阻滞在第一次减数分裂的MⅠ期，导致卵母细胞纺锤体的长度变短和面积减小以及纺锤体组装检验点蛋白Bub3在着丝粒的持续定位。
除此之外，本文还对NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达和功能进行了研究。通过Western blotting检测了NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达，通过将Nek5siRNA注射到1-cell期胚胎中敲降Nek5的表达研究NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的作用。研究结果显示，NEK5在着床前胚胎发育的各个阶段均有表达，在囊胚期的表达水平最高，Nek5的敲降导致大多数胚胎停滞在2-cell期，严重阻碍小鼠着床前胚胎的发育。
本项研究首次证明，NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程中发挥重要的作用。
（2）PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究
PTHLH在着床前胚胎发育过程中发挥重要的作用，但是PTHLH影响小鼠着床前胚胎发育过程中囊胚形成、转录因子/多能性基因表达以及组蛋白乙酰化修饰的调控机制并不清楚。本研究着重探讨了PTHLH影响小鼠着床前胚胎发育的作用机制。首先，本研究通过显微注射的方法对小鼠着床前胚胎中的Pthlh进行敲降，发现Pthlh的敲降导致囊胚形成率的降低，与之前的研究结果一致。其次，还对各时期的胚胎发育进行统计观察发现，Pthlh的敲降导致2-cell、4-cell、8-cell和morula期的胚胎发育率均显著降低。桑椹期胚胎细胞数目的统计结果显示，Pthlh的敲降导致桑椹期胚胎细胞数目的显著降低。前期研究发现，Pthlh的敲降对小鼠卵母细胞成熟过程没有影响，
通过RT-PCR分别检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中Ccnd1和Akt1/2的mRNA水平，应用Western blotting和免疫荧光方法检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中cyclin D1、AKT和p-AKT（Thr308）的蛋白水平。Western blotting结果显示，Pthlh的敲降导致2-cell、4-cell、8-cell和morula期胚胎中cyclin D1和p-AKT（Thr308）的蛋白水平显著降低。免疫荧光结果也显示，Pthlh的敲降导致cyclin D1和p-AKT（Thr308）的荧光强度的降低。RT-PCR结果显示，Ccnd1、Akt1和Akt2的mRNA水平没有明显变化。
通过RT-PCR检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中Hdac4的mRNA水平，通过Western blotting和免疫荧光方法检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中HDAC4的蛋白水平和定位情况。Western blotting和RT-PCR结果显示，Pthlh的敲降对2-cell、4-cell、8-cell和morula期胚胎中HDAC4的蛋白水平和mRNA水平没有影响。免疫荧光结果显示，Pthlh的敲降导致着床前胚胎细胞核中HDAC4的增加。
通过RT-PCR和Western blotting检测Pthlh敲降胚胎中β-catenin、RUNX2、CDK4和E2F的表达水平。结果显示，Pthlh的敲降对胚胎中β-catenin、RUNX2和CDK4的蛋白表达没有影响，但导致转录因子E2f的mRNA水平显著降低。
此外，还通过在GV期卵母细胞和1-cell胚胎中注射外源的Myc-Pthlh mRNA进行Pthlh的过表达。结果显示，Pthlh的过表达对小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育没有影响。
本项研究首次证明PTHLH通过AKT/cyclin D1通路和HDAC4的核易位参与调控小鼠着床前胚胎发育过程中胚胎卵裂、囊胚发育、多能性基因的表达以及组蛋白的乙酰化修饰。此外，还证明Pthlh过表达不影响小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育。
综上所述，本研究首次发现NEK5和PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中发挥重要的作用。本文对深入理解哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育分子机制具有重要意义，为开展大动物研究提供借鉴和指导，为人类健康提供理论基础。
本研究主要开展的工作和结果如下：
（1）NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究
本文对NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程中的表达、定位和功能进行研究。通过Western blotting检测NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达情况，NEK5在GⅤ~MⅡ期均有表达，在GⅤ期的表达水平最高。将体外转录获得的Myc-Nek5mRNA以400ng/μl的浓度注射到GV期卵母细胞中，通过用anti-Myc抗体进行免疫荧光染色检测NEK5的定位。结果显示，NEK5在GⅤ期定位于细胞质中，在GVBD期定位于染色体周围，在Pro-MⅠ~MⅡ期定位在纺锤体上。为了研究NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的作用，将Nek5siRNA（small interfering RNA）注射到GⅤ期卵母细胞中以敲降Nek5的表达。研究结果显示，Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞的GVBD率降低，CDK1的活性降低，卵母细胞减数分裂恢复失败，但不影响CDC25B易位到卵母细胞的生发泡。进一步研究发现，Wee1B的敲降和cyclin B1的过表达可以挽救Nek5敲降导致的卵母细胞的减数分裂恢复失败，但Cdc25的过表达不能挽救Nek5敲降导致的卵母细胞的减数分裂恢复失败。也对NEK5在卵母细胞减数分裂中/后期转换中的作用进行研究。研究结果显示，Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞减数分裂第一极体排出率降低，使卵母细胞被阻滞在第一次减数分裂的MⅠ期，导致卵母细胞纺锤体的长度变短和面积减小以及纺锤体组装检验点蛋白Bub3在着丝粒的持续定位。
除此之外，本文还对NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达和功能进行了研究。通过Western blotting检测了NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达，通过将Nek5siRNA注射到1-cell期胚胎中敲降Nek5的表达研究NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的作用。研究结果显示，NEK5在着床前胚胎发育的各个阶段均有表达，在囊胚期的表达水平最高，Nek5的敲降导致大多数胚胎停滞在2-cell期，严重阻碍小鼠着床前胚胎的发育。
本项研究首次证明，NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程中发挥重要的作用。
（2）PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究
PTHLH在着床前胚胎发育过程中发挥重要的作用，但是PTHLH影响小鼠着床前胚胎发育过程中囊胚形成、转录因子/多能性基因表达以及组蛋白乙酰化修饰的调控机制并不清楚。本研究着重探讨了PTHLH影响小鼠着床前胚胎发育的作用机制。首先，本研究通过显微注射的方法对小鼠着床前胚胎中的Pthlh进行敲降，发现Pthlh的敲降导致囊胚形成率的降低，与之前的研究结果一致。其次，还对各时期的胚胎发育进行统计观察发现，Pthlh的敲降导致2-cell、4-cell、8-cell和morula期的胚胎发育率均显著降低。桑椹期胚胎细胞数目的统计结果显示，Pthlh的敲降导致桑椹期胚胎细胞数目的显著降低。前期研究发现，Pthlh的敲降对小鼠卵母细胞成熟过程没有影响，
通过RT-PCR分别检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中Ccnd1和Akt1/2的mRNA水平，应用Western blotting和免疫荧光方法检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中cyclin D1、AKT和p-AKT（Thr308）的蛋白水平。Western blotting结果显示，Pthlh的敲降导致2-cell、4-cell、8-cell和morula期胚胎中cyclin D1和p-AKT（Thr308）的蛋白水平显著降低。免疫荧光结果也显示，Pthlh的敲降导致cyclin D1和p-AKT（Thr308）的荧光强度的降低。RT-PCR结果显示，Ccnd1、Akt1和Akt2的mRNA水平没有明显变化。
通过RT-PCR检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中Hdac4的mRNA水平，通过Western blotting和免疫荧光方法检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中HDAC4的蛋白水平和定位情况。Western blotting和RT-PCR结果显示，Pthlh的敲降对2-cell、4-cell、8-cell和morula期胚胎中HDAC4的蛋白水平和mRNA水平没有影响。免疫荧光结果显示，Pthlh的敲降导致着床前胚胎细胞核中HDAC4的增加。
通过RT-PCR和Western blotting检测Pthlh敲降胚胎中β-catenin、RUNX2、CDK4和E2F的表达水平。结果显示，Pthlh的敲降对胚胎中β-catenin、RUNX2和CDK4的蛋白表达没有影响，但导致转录因子E2f的mRNA水平显著降低。
此外，还通过在GV期卵母细胞和1-cell胚胎中注射外源的Myc-Pthlh mRNA进行Pthlh的过表达。结果显示，Pthlh的过表达对小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育没有影响。
本项研究首次证明PTHLH通过AKT/cyclin D1通路和HDAC4的核易位参与调控小鼠着床前胚胎发育过程中胚胎卵裂、囊胚发育、多能性基因的表达以及组蛋白的乙酰化修饰。此外，还证明Pthlh过表达不影响小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育。
综上所述，本研究首次发现NEK5和PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中发挥重要的作用。本文对深入理解哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育分子机制具有重要意义，为开展大动物研究提供借鉴和指导，为人类健康提供理论基础。