生物法生产丙烯酰胺是工业生物催化技术成功用于生产大宗化学品的典型范例，其核心技术包括高活力生物催化剂的制备，丙烯腈水合工艺的优化，以及生物催化剂的适应性改造。改进和优化腈水合酶发酵制备工艺，提高腈水合酶对于丙烯酰胺的耐受性及产物终浓度是改进生物法生产丙烯酰胺工艺的研究重点。 该文以丙烯酰胺生产菌Nocardiasp.为研究对象，优化了腈水合酶的制备工艺，开发了葡萄糖-Co2+耦合补加工艺；纯化了腈水合酶并对其基本性质进行了表征，研究了纯化酶的催化动力学；以纯化酶和完整细胞的催化与失活为理论基础，优化了丙烯腈水合工艺；对催化剂进行了适应性改造，驯化筛选出丙烯酰胺耐受性好的新菌株并开发了高浓度丙烯酰胺生产工艺。 第一章首先对工业生物催化发展状况进行了综述，重点介绍了生物法催化生产丙烯酰胺的重要意义、发展过程及工艺流程，并分析了现有工艺的问题与不足。指出了微生物发酵制备腈水合酶、提高生物催化剂对于丙烯酰胺的耐受性进而提高丙烯酰胺终浓度是生物催化法生产丙烯酰胺的关键。这章还介绍了腈水合酶的研究进展，分析了已有的腈水合酶的纯化方法、结构及酶学特性。最后提出了该论文的研究内容和整体框架。 第二章首先分析了原有腈水合酶制备工艺即对照工艺的菌体生长和产酶过程，提出原有工艺的问题与不足，提出了可能的解决方案。考察了pH调控和葡萄糖补加对菌体生长和产酶的影响，在此基础上，研究了对照工艺、pH阶段和连续调控工艺及不同发酵时期的葡萄糖补加工艺中，Nocardiasp.RS菌体生长和产腈水合酶的规律。研究了产酶速率与耗糖速率的动力学关系，以此为依据优化了腈水合酶的制备工艺。 第三章利用色谱技术纯化了Nocardiasp.RS腈水合酶，并对纯酶的基本性质进行了表征，根据腈水合酶亚基N-末端氨基酸测序的结果，设计简并引物从Nocardiasp.RS中克隆出该酶的基因并测序，推导出该酶的氨基酸序列。结果表明纯化的腈水合酶为一新酶，与同源腈水合酶进行序列比较发现Nocardiasp.腈水合酶为钴型，为后续腈水合酶制备工艺中钴离子调控研究提供了理论依据。 第四章针对钴离子在Nocardiasp.RS腈水合酶制备中的消耗情况与产酶的关系，揭示了钴离子对于Nocardiasp.RS腈水合酶合成和活性表达的机理，结果表明腈水合酶制备工艺中Co2+不仅能增加酶量，而且可以促进腈水合酶亚基形成有活性的酶。进而开发了新的腈水合酶制备工艺——葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，酶活达到了10，195U·mL-1，是目前国内外腈水合酶制备研究的最高水平。 第五章分别以纯化酶和含有腈水合酶的完整细胞为研究对象，揭示了酶和底物的反应规律以及各种因素对酶反应速率和稳定性的影响。研究了纯化酶的最适反应温度和最适pH、酶的热稳定性、不同类型的抑制剂对酶活和结构的影响，首次利用紫外光谱法实时研究了腈水合酶的催化过程，并得到了纯化酶的底物反应动力学。研究了完整细胞的最适pH和热稳定性及丙烯腈和丙烯酰胺对催化速率的影响，用Hill模型解释了丙烯腈流加方式下的催化速率和底物浓度的关系，并得到了最适的丙烯腈浓度范围。 第六章利用极端条件驯化法改造了Nocardiasp.RS的丙烯酰胺耐受性，将菌体培养、酶催化和驯化筛选高丙烯酰胺耐受性菌体这三个过程耦合在一起，研究了驯化过程中菌体存活率的变化情况。得到了腈水合酶活力高、产物耐受性好的菌株RS-1。以此为基础，在小型反应器规模上实现了高浓度丙烯酰胺的生产，终浓度达到了641g·L-1。开发了水合-结晶新工艺，建立了催化剂用量的工艺包，并对新工艺的能耗进行了评估。