茶树是多年生常绿木本植物,主要分布在热带和亚热带地区,低温是限制茶树生长最重要的环境因素之一。糖是植物维持生命活动所需能量的主要来源,在植物正常的生长生殖发育及响应生物和非生物胁迫中起重要作用。植物根据库器官对糖的需求进行分配,糖从源器官进入库器官需要与膜上的载体蛋白结合才能完成跨膜转运,这些转运糖的膜蛋白被称为糖转运蛋白。当遭受低温胁迫时,植物体内可溶性糖含量增加,糖转运蛋白通过平衡、分配糖的分布,维持细胞渗透势平衡,从而提高植物的抗寒能力。SWEETs(sugars will eventually be exported transporters)家族是单糖转运蛋白,包含七个跨膜螺旋和两个MtN3保守结构域,广泛存在于植物、动物和原核生物中。已有研究表明,SWEETs糖转运蛋白在植物的生长生殖发育、生物胁迫和非生物胁迫(如低温)中发挥重要作用。本研究分析了 13个CsSWEETs的序列信息,采用荧光定量PCR方法检测了 CsSWEETs在不同组织和花发育阶段以及不同胁迫下的表达模式,从中筛选出低温响应基因CsSWEET1a,CsSWEET16和CsSWEET17进行深入研究。通过转化酵母己糖转运体缺失突变体鉴定它们的糖转运能力,通过转化拟南芥并结合生理和分子生物学方法对低温响应基因CsSWEET1a,CsSWEET16和CsSWEET17进行了功能鉴定。主要研究结果如下:1.CsSWEETs基因的克隆和生物信息学分析。应用RT-PCR技术从茶树中克隆鉴定8个CsSWEETs基因,根据与拟南芥AtSWEETs基因的同源性进行命名。结合前期克隆的5个基因,分析发现13个CsSWEETs基因都具有SWEET家族典型的MtN3结构域和七个跨膜结构。通过与拟南芥、水稻和葡萄SWEET家族成员氨基酸序列构建进化树,将13个CsSWEETs蛋白分为4个亚家族。2.CsSWEETs基因的表达和糖转运能力分析。组织特异性表达分析发现,CsSWEET1 a/1b/2a/2b/2c/3/9b/16/17在所有的组织中都表达,而CsSWEET5/7/9a/15在某些组织如成熟叶片中未检测到表达。13个CsSWEETs基因在花发育过程中的表达模式可以分为三类。分析9个能在成熟叶片中表达的CsSWEETs基因对非生物胁迫、自然冷驯化和茶树炭疽菌侵染的响应模式,发现有8个CsSWEETs基因能够响应非生物胁迫,而CsSWEET3响应炭疽菌感侵染。通过转化酵母己糖转运体缺失突变体,发现CsSWEET1a/1b/7/17对葡萄糖类似物和一种或多种己糖分子具有转运能力。3.CsSWEET16提高转基因拟南芥的抗寒性。CsSWEET16属于第Ⅳ亚家族,其表达受低温抑制。通过对启动子接GUS株系的GUS染色分析发现,正常情况下在叶片、根、花和果中都有活性,而低温条件下这些组织中的GUS活性减弱。亚细胞定位显示CsSWEET16蛋白定位在液泡膜。低温条件下,与野生型植物相比,过表达CsSWEET16的转基因株系的相对电导率降低,Fv/Fm值增大,可溶性糖和葡萄糖含量增加,而果糖含量降低。此外,CsSWEET16可以回复atsweet16-1突变体果糖积累的表型。这些结果表明CsSWEET16通过调节液泡内外的可溶性糖分配,增强拟南芥的抗寒能力。4.CsSWEET17的C端影响糖转运能力。CsSWEET17属于第Ⅳ亚家族,其拟南芥同源基因以及同属于第Ⅳ亚家族的CsSWEET16都定位于液泡膜,而亚细胞定位结果显示CsSWEET17定位于细胞膜。通过氨基酸序列比对,发现CsSWEET17跨膜结构域外的C端比AtSWEET17多67个氨基酸,去除该C端后,CsSWEET17的细胞膜定位特性未受影响,但对果糖、葡萄糖和甘露糖的转运能力减弱。5.超表达CsSWEET1a和CsSWET17能够提高糖转运能力。不同糖浓度处理发现,CsSWEET1a-OE株系在高糖浓度下无法正常生长,在低糖浓度下叶片颜色变黄。CsSWEET1 7-OE株系在高糖浓度下的发芽率较野生型低,而在低糖浓度下长势较野生型好。此外,正常土培下的CsSWEET17-OE株系的莲座叶和种子都比野生型大。6.CsSWEET1a和CsSWEET17提高转基因拟南芥的抗冻性。CsSWEET1a和CsSWEET17的表达受低温诱导。亚细胞定位显示CsSWEET1a和CsSWEET17蛋白都定位在质膜上。酵母双杂交和双分子荧光互补实验分析发现CsSWEET1a和CsSWEET17具有相互作用。冷冻条件下,与野生型相比,过表达CsSWEET1a和CsSWET17的转基因株系的相对电导率显著降低,蔗糖转化酶AtCWINVs和AtVACINVs基因的表达被抑制。研究结果表明,CsSWEET1a和CsSWEET17在质膜上形成同源/异源二聚体,并介导糖在细胞质和质外体之间的分配,从而调控植物的生长和抗冻性。