植物内生真菌种类丰富多样,它们的全部或部分生活阶段在健康植物的各种组织和器官内,对宿主不表现明显病害。植物内生真菌尤其是药用植物的内生菌由于其次生代谢产物种类丰富、结构新颖、活性优良,有一些甚至还能产生与宿主植物有效成分化学结构、功能相近的化合物而受到越来越多的关注。狭叶南五味子作为一味中国传统中药能够活血化瘀促进血液循环,主要用于治疗骨折和月经不调等疾病。天然产物研究表明五味子类植物主要的两种成分是木质素类和三萜类。其中,近年来从五味子科植物中发现了一系列结构新颖的萜类化合物,并且具有抗炎、抗肿瘤、抗HIV等多种药学活性,这些研究成果都引起人们新的兴趣。然而,目前对于五味子三萜类化合物的研究还不够深入,并且对于狭叶南五味子内生真菌次生代谢产物的系统研究基本没有。基于此,本研究以团队前期分得的狭叶南五味子内生真菌为研究对象,利用色谱筛选方法寻找可以产生五味子代表活性三萜——尼哥纳乐酸(nigranoic acid)的内生真菌,并对其进行形态学分子学的鉴定。其次,选用一株前期筛选出的可以转化狭叶南五味子的内生真菌,扩大培养,利用一系列的色谱分离手段,对其次生代谢产物进行研究分析,再结合各种波谱数据,解析化合物结构,以获得一系列新颖的五味子三萜类化合物。该项研究通过分析代谢产物的不同来探究内生真菌与植物的关系,以及其在植物本身代谢中的作用。同时研究得到的结构新颖的化合物,可以为进一步的活性研究以及内生真菌资源的利用提供理论基础。研究具体结果如下:实验室在前期的工作中已经从狭叶南五味子的根茎部分得到了293株内生真菌,初步归属于22个属。采用改良液体培养基(PDB)让这些菌分别进行小规模发酵,并对发酵液进行萃取,得到发酵粗产物。以nigranoic acid为标准品,利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术对代谢产物进行分析,从中筛选到了一株保藏名为SWUKD 3.1601的菌株可能有产nigranoic acid的能力。根据菌株的宏观显微形态,同时结合分子生物学的鉴定方法(以ITSl和ITS4为引物,对ITS序列进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了测序,建树)鉴定目标菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。哈茨木霉在以往的研究中主要是作为生物防治菌,常被用来预防由病原菌引起的植物病害。这个研究也提供了一个依靠发酵获得nigranoic acid的方法,为解决植物资源有限的问题提供新途径。另外,筛选出一株具有显著催化活性并且次生代谢产物丰富的内生真菌,鉴定为青霉菌(Penicillium ochrochloron SWUKD4.1850)。以狭叶南五味子藤茎部分作为固体培养基,接种该菌进行大量发酵。用丙酮浸提得到次生代谢的粗产物。采用常规的分离技术:以薄层色谱(TLC)示踪,运用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备薄层层析以及重结晶等分离手段对代谢产物分离纯化,得到的单体化合物利用各种现代波谱技术(UV、IR、旋光、EI-MS、HR-ESI-MS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、ROESY、X单晶衍射等)进行结构解析鉴定,最终确定得到了12个五味子三萜化合物。其中wuweizidilactone Q(1),henrischinins D-I(2-7)为7个新发现的化合物,henrischinin A(8),henrischinin B(9),schirubridilactone D(10),wuweizidilactone D(11),lancifodilactone D(12)为5个已知的五味子三萜。这些五味子三萜根据结构特征主要归属于18-Norschiartane-type,(21,24-Cyclo)-3,4;9,10-seco-cycloartane-type,Schisanartane-type,18(13,14)-abeo-Schiartane-type四个大类。其中已知的化合物henrischinin A-B被报道具有抗HSV-2(EC50=0.24mg/mL)活性,对癌细胞有毒性(HL-60 IC50=16.5,10.5μM),schirubridilactone D具有抗HIV-1活性(EC50=80.8mg/mL)。与五味子本身就含有的五味子三萜相比,内生真菌共发酵得到的三萜的氧化度普遍较高,推测可能是微生物对宿主的化学成分进行了转化,说明五味子萜类的生成可能与植物内内生真菌的存在和参与有关。本工作通过对狭叶南五味子内生真菌三萜类次生代谢产物的研究,发现了特殊的菌株和一些结构新颖的次生代谢产物,预示了植物内生真菌作为植物系统的重要组成部分,是有待深入研究的能产生具有新结构或新活性天然产物的重要资源。