目的:通过代谢组学方法来鉴定自然流产患者血清与正常妊娠妇女的差异,以确定自然流产发病的可能机制与途径,与此同时检测自然流产患者与正常妊娠妇女的绒毛组织MDA、SOD表达差异,旨在证明甲基化异常的病理绒毛组织是否存在氧化应激状态。通过检测自然流产患者的FTO、m6A mRNA含量,旨在验证自然流产患者的RNA甲基化异常及寻找导致RNA修饰紊乱的关键酶;通过研究自然流产患者和正常妊娠妇女绒毛组织的HLA-G、MMP2、MMP7、MMP9、VEGFA、VEGFR,旨在验证自然流产绒毛组织的免疫耐受、侵袭迁移和血管生成功能差异;通过RIP实验和过表达沉默FTO基因,证明自然流产患者滋养层细胞FTO的下游基因m6A以及与m6A的关系。通过Erastin诱导HTR-8/Snveo细胞构建缺氧模型,同时探讨FTO对RNA m6A甲基化以及滋养层细胞侵袭迁移和血管生成功能的调控影响,并且明确减味寿胎丸对RNA甲基化及细胞表型的影响。通过计算机辅助计算模拟分子对接,模拟减味寿胎丸有效成分与HLA-G结合模式和构象,来了解减味寿胎丸中治疗SA的活性成分与SA分子靶点HLA-G之间的相互作用方式。方法:1.临床实验通过UPLC/MS,检测SA与正常妇女血清的代谢差异,通过酶标仪法,检测绒毛组织中MDA、SOD变化;通过qRT-PCR、WB方法及ELISA大样本验证绒毛组织去甲基化酶FTO表达水平;通过免疫荧光标记FTO、HLA-G及m6A;通过qRT-PCR进行临床筛查及验证绒毛组织中HLA-G、基质金属蛋白酶家族、血管内皮生长因子的表达差异;进一步通过RIP实验验证绒毛组织FTO与表型功能RNA的结合力,m6A与表型功能RNA的结合力;2.细胞实验通过过表达和干扰FTO,验证滋养细胞侵袭迁移、血管生成功能变化;通过Ertain诱导滋养细胞建立缺氧模型,检测FTO表达变化、RNA甲基化水平以及侵袭迁移、血管生成功能变化;在基于上述缺氧模型和转染细胞,加入减味寿胎丸,通过PCR、WB检测RNA甲基化水平、侵袭迁移和血管生成功能;3.分子对接通过色谱学技术和检索TCMSP数据库,确定减味寿胎丸主要有效成分;通过计算机辅助模拟技术,将HLA-G蛋白三维结构与减味寿胎丸活性小分子的三维结构进行对接,模拟结合构象,分析减味寿胎丸有效成分与HLA-G的结合位点和结合亲和力。结果:1.临床研究:UPLC/MS分析自然流产患者血清代谢轮廓,共鉴定出96个特征代谢物,定位到29条代谢途径,其中5条途径有显著改变（raw P<0.05）。自然流产患者差异代谢产物主要与胆碱代谢和甾体激素合成有关。胆碱代谢（包括甘油磷脂途径、磷脂酰胆碱生物合成途径、蛋氨酸途径和甜菜碱途径）与甲基化密切相关。与正常妊娠妇女相比,自然流产患者的绒毛组织MDA表达水平显著增多,SOD表达显著降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光标记法检测SA患者较正常妊娠妇女FTO和HLA-G标记减少,FTO减少,m6A表达上调。RT-PCR检测SA患者绒毛组织中FTO mRNA较正常妊娠妇女下调、m6A mRNA表达上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。SA患者较正常妊娠妇女绒毛组织中HLA-G、VEGFR表达减少,MMP7、MMP9表达上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。SA患者较正常妊娠妇女绒毛组织中VEGFA、MMP2表达上调,差异无统计学意义（P>0.05）。加大样本量ELISA检测自然流产患者绒毛组织FTO表达下调。RIP检测发现与正常妊娠妇女相比,自然流产患者和FTO结合的HLA-G、VEGFR、MMP9RNA富集倍数显著降低,和m6A结合的HLA-G、VEGFR、MMP9RNA富集倍数显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常妊娠妇女相比,自然流产患者和FTO结合的MMP7显著升高,自然流产患者和m6A结合的MMP7RNA富集倍数也显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常妊娠妇女相比,自然流产患者和FTO结合的MMP2、VEGFA下调,与m6A结合下调,差异无统计学意义（P>0.05）。2.细胞实验用Erastin诱导HTR-8/Snevo细胞构建氧化应激模型,CCK8检测不同浓度Erastin作用于HTR-8/Snevo细胞不同时间,结果显示Erastin处理细胞后,细胞的活力降低,并且100uM效果最显著,差异具有统计学意义（P<0.05）,而HTR-8/Snveo细胞活力随着时间的增加而降低,最终选用100μM浓度和24h为作用浓度和时间点;发现造模后去甲基化酶FTOmRNA下调,再用减味寿胎丸干预氧化应激状态细胞系,发现FTO和MMP2蛋白均上调,差异具有统计学意义（P<0.05）,但VEGFR未见明显改变。在Erastin诱导HTR8/Svneo滋养细胞氧化应激状态后,加入减味寿胎丸,以观察不同浓度、不同时间减味寿胎丸对细胞生长的影响,用酶标仪检测吸光度值,通过计算得出结果。结果显示,与DMSO组相比,细胞在Erastin作用后细胞活力降低。与Erastin组相比,不同浓度的减味寿胎丸作用模型细胞后,其活力明显提高,并且随时间的增加而升高,呈浓度依赖性和时间依赖性,差异具有统计学意义。最终选用0.1mM浓度和24h为作用浓度和时间点。进一步在HTR-8/Svneo细胞系中过表达FTO,通过WB检测FTO蛋白升高,与此同时,在发现滋养细胞的MMP2蛋白上调,差异具有统计学意义（P<0.05）,VEGFR未见明显改变,但是差异无统计学意义;在过表达FTO后加入减味寿胎丸后,发现FTO和MMP2蛋白都下调,但VEGFR未见明显改变。在细胞系中干扰FTO,发现FTO与MMP2蛋白均下调,差异具有统计学意义（P<0.05）减味寿胎丸能够恢复FTO下调的趋势,使滋养细胞的迁移和侵袭功能增加,但VEGFR未见明显改变。3.分子对接减味寿胎丸中共有96种有效成分,菟丝子的主要活性成分是黄酮类,桑寄生的主要活性成分是甾类,续断的主要活性成分为三萜皂苷类;菟丝子中的活性成分紫云英苷、桑寄生中的活性成分槲皮苷、续断中的活性成分川续断皂苷Ⅵ、常春藤皂苷元、马钱苷显示了与HLA-G较强的结合能力结论:1.自然流产患者胆碱代谢下调,说明自然流产妇女可利用的甲基化供体较少,这提示自然流产RNA甲基化修饰存在异常。自然流产患者的临床绒毛组织中存在氧化应激状态;2.自然流产患者的绒毛组织中FTO呈下调趋势,而相关表型功能基因HLA-G、VEGFR、也呈下调趋势,MMP2、MMP7、MMP9和VEGFA呈现上调趋势,而m6A修饰呈升高趋势,FTO可能是自然流产患者m6A异常累积的主要原因;3.减味寿胎丸通过调节去甲基化酶FTO基因调控m6A修饰从而达到调控自然流产母胎界面的滋养层细胞的侵袭迁移功能;4.减味寿胎丸能够与HLA-G能够进行有效分子-分子对接,激活母胎界面HLA-G可能是减味寿胎丸有效部位治疗SA的作用机制之一。