当培养的大肠杆菌由对数生长期进入稳定期时，与生长相关的基因便停止表达，而且同时一些稳定期特异性的基因开始表达，启动这些基因表达的启动子应具有一定的稳定期特异性。如果能分离出这些启动子中启动能力及稳定期特异性较强的启动子并构建成相应的表达载体，那么使用这些载体进行外源基因的表达时，载体自身便具有了特异性的稳定期启动表达的能力。从而无需测量菌液的OD来判断菌体生长何时到达稳定期，而且也无需像使用pET表达系统时添加IPTG等诱导物来启动表达，载体本身将自主控制进入稳定期后自动表达。为了分析大肠杆菌K12株中有哪些基因是进入稳定期才启动表达的，利用DNA芯片技术分析了JM109和BL21两种菌株中三个不同生长阶段各种基因表达量的变化情况，解析出进入稳定期后表达量上调的基因。为了深入了解稳定期特异性启动子的强度及特异性，结合RegulonDB等网站上预测的大肠杆菌启动子序列，分离了上述基因中20个基因起始密码子上游500bp左右的DNA片段。为了检测各种启动子的强度及特异性，构建了带有β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)报告基因的报告系统。通过该报告系统，在底物(ONPG)作用下检测β-半乳糖苷酶表达量以及是否为稳定期特异性表达，其中共有4个启动子具有明显的稳定期特异性的启动功能。为了进一步优化分离得到的启动子的表达效果，构建了pSP系列表达载体。该系列载体中带有Amp~R及Tet~R两种抗性基因；在启动子上游插入了终止子来抑制本底表达；增加了H-N标签以及肠激酶(EK)切割位点以便表达产物的纯化和分离；增加了一段含有7个限制酶识别位点的多克隆位点，方便外源基因的克隆；在多克隆位点的下游加入强终止信号。使用构建好的该系列载体，通过SDS-PAGE的方法对calpastatin基因进行表达评价，结果与β-半乳糖苷酶报告系统基本一致，说明该系列载体可以应用于外源基因的表达。