猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病。在临床上,由强毒引起、发病率和死亡率均较高的称为急性猪瘟,而弱毒感染引起的猪瘟由于不表现临诊症状则可能不易被察觉。猪瘟呈世界性分布,一旦暴发,会对养猪业造成重大经济损失,所以WHO将其列入法定的A类传染病,我国也将其列为一类动物疫病。猪瘟病毒的基因组是单股正链线状RNA,全长大小约为12.3kb。其5’端无甲基化帽子结构,但有稳定的二级结构,还有多个不能启动翻译蛋白的隐形AUG密码子存在,3’端没有poly(A)尾巴结构,在所有的瘟病毒属中,3’端的保守性很高,尤其是最后大约100nt的区域内。α-干扰素之所以能够发挥其抗病毒作用,是因为它能够与其在效应细胞膜上的受体结合,内化后进入细胞,诱导效应细胞合成某些具有活性的蛋白质。Ⅰ型干扰素是细胞免疫抵御病毒病原体的第一道防线,其信号传导的结果就是干扰素刺激基因(ISGs)被广泛上调,来靶向阻击病毒生命周期的不同阶段:入胞、复制、装配和释放。Mx蛋白是是Ⅰ型干扰素(α/β)和Ⅲ型干扰素(γ)刺激后产生的细胞抗病毒感染的关键调节因子。它们属于大GTP酶的动态蛋白超家族,这个家族与细胞内囊泡的运输和细胞内环境的稳态有关。Mx蛋白具有广泛的抗RNA病毒的活性,其抗病毒机理是病毒被抑制在其生命周期的早期阶段:进入宿主细胞后、基因组开始复制前这一时期。自从被发现有抗病毒作用后,Mx蛋白就开始被广泛研究,目前已成为抗病毒研究的热点。到目前为止,研究者已经发现人MxB蛋白能抑制HIV-1的增殖、人MxA蛋白和猪Mx1蛋白能抑制CSFV的增殖、猪Mx2蛋白能抑制VSV和流感病毒的增殖等。本研究围绕着猪Mx2蛋白对CSFV的作用开展了以下试验:1.干扰素α抗猪瘟病毒研究本部分研究探讨了干扰素α对猪瘟病毒的抑制作用的浓度依赖性和时间依赖性。结果显示,用10、50、100和300ng/mL浓度的干扰素αα处理猪肾细胞(PK-15),随着干扰素处理浓度的升高,抑制猪瘟病毒的效果越明显,相对于空白对照组的抑制率分别为40%、67%、83%和91%。而使用浓度为300ng/mL干扰素α处理PK-15细胞后,在24h时抑制CSFV效果最明显,抑制率达到95%。另外,本试验在PK-15细胞受到干扰素α刺激后,细胞内Mx2的变化情况进行了探究。结果显示,刺激细胞的干扰素α浓度越高,Mx2上调变化越明显,并且其变化在24h之内呈现时间依赖性。2.猪Mx2抗猪瘟病毒的初步研究根据猪Mx2基因序列设计了两对特异性引物,通过RT-PCR从猪IFN-α刺激的PK-15细胞中扩增了 Mx2的前半段(1170bp)和完整的全长(2136bp)两个目的片段,经过酶切和测定序列后,分别克隆到真核表达载体pFLAG(1170bp)和pEGFP-C1(2136bp)中,成功构建了两个重组质粒pFLAG-Mx2和pEGFP-Mx2,并且经过Western blot试验验证,两个重组质粒均能在细胞中正确表达,蛋白大小分别为48KDa和102KDa,进一步激光共聚焦试验验证,两个重组质粒的亚细胞定位都是在细胞质中。进一步研究了猪Mx2蛋白对猪瘟病毒的抑制作用。将重组质粒pFLAG-Mx2和pEGFP-Mx2瞬时转染到PK-15细胞中,实时荧光定量RT-PCR结果显示,pFLAG-Mx2和pEGFP-Mx2都能抑制猪瘟病毒的增殖,抑制效率分别为56%和67%,呈现剂量依赖性,均在CSFV接种后的12-24h期间抑制作用逐渐增强。间接免疫荧光试验结果显示,转染质粒pFLAG-Mx2的细胞孔中代表CSFV的绿色荧光斑数量要明显少于转染空载体pFLAG的细胞孔,说明重组质粒pFLAG-Mx2在细胞中表达的Mx2蛋白对CSFV有抑制作用。激光共聚焦试验结果表明,质粒pEGFP-Mx2在细胞中表达的Mx2蛋白能抑制CSFV的增殖,但是抑制作用不是通过其与CSFV囊膜糖蛋白E2的相互作用来实现的。3.猪瘟病毒Core蛋白的原核表达、抗体制备及应用根据猪瘟病毒衣壳蛋白(Core)基因序列设计一对特异性引物,RT-PCR从猪瘟兔化弱毒中扩增出完整的Core基因,经酶切和序列测定后,克隆到携带His标签的原核表达载体pColdI中,成功构建了重组质粒pCold-Core,将其转化到大肠杆菌Rosseta 2(R2)中,利用IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定表达效果。结果表明:经终浓度为0.1mmol/L IPTG诱导24h后,Core基因在R2中获得分泌性可溶表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量为20kDa。Western blot结果显示Core蛋白可以分别与His单抗和猪瘟病毒阳性抗血清发生特异性反应,均出现单一反应带。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备特异性抗血清,Western blot结果显示该抗血清与衣壳蛋白反应后有明显的特异性条带。经激光共聚焦鉴定抗血清能够与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应,这说明Core基因表达成功,制备的抗血清具有生物学功能。