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背景和目的由于大部分胰腺癌患者被确诊时疾病已经发展至进展期,因而丧失了通过手术完全切除肿瘤的机会。加之胰腺癌对于放疗、化疗治疗的敏感性有限。使得寻找有关胰腺癌诊断、治疗及判断患者预后的新标志物意义重大。胰腺星形细胞(PSC)与胰腺癌细胞的相互作用是胰腺癌发病机制研究的热点,这两种细胞间的相互作用能更真实地模拟胰腺癌复杂的微环境。本文内容包括两个部分：第一部分对AREG/EGFR在胰腺癌中的表达及其作用进行探讨。(1)对EGFR、EGFRvⅢ和AREG在胰腺癌组织中的表达情况及其与病人的临床病理特征和预后的相关性进行研究；(2)对AREG/EGFR信号轴介导胰腺癌EMT效应及相关机制进行研究。第二部分对人胰腺星形细胞进行永生化建系处理,为后期继续研究AREG在PSC中所起的作用提供实验材料基础。方法第一部分(1)首先,采用免疫组织化学染色对92例胰腺导管腺癌组织进行EGFR、EGFRvⅢ和AREG表达检测,通过卡方检验判断EGFR、EGFRvⅢ、AREG及AREG/EGFR共表达情况与胰腺癌临床特征的关系,利用Pearson检验对AREG表达和EGFR表达之间进行相关性分析；制作Kaplan-Meier生存曲线,通过log-rank检验比较高表达/低表达组间的生存差异,最后利用COX回归进行多因素分析。(2)利用RNA干扰技术和重组蛋白研究AREG对胰腺癌细胞系自身侵袭和迁移能力的影响。采用细胞划痕实验,细胞迁移实验和细胞侵袭实验验证细胞运动能力,使用MMP/TIMP蛋白质芯片筛选AREG对胰腺癌MMP/TIMP蛋白质表达的影响,利用Western blot验证AREG/EGFR对胰腺癌细胞系EMT蛋白及转录因子的表达的影响,使用EGFR、MEK1/2和NF-κB抑制剂验证AREG/EGFR活化下游信号通路改变情况。同时,验证AREG在4例原代培养PSC中的表达情况,研究PSC对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。第二部分建立人胰腺星形细胞永生化细胞系。使用重组慢病毒将SV40LT抗原基因和hTERT基因导入原代hPSC,经过嘌呤霉素抗性筛选及扩大培养。通过光学显微镜、免疫组化、染色体核型分析、生长曲线测定、裸鼠成瘤实验等研究其生物学特性。结果第一部分(1)在胰腺癌组织中,EGFR阳性表达率为46.7%(43/92),EGFRvIII阳性表达率为13%(12/92),AREG阳性表达率为53.3%(49/92)。EGFR和EGFRvIII阳性表达部位为细胞膜及细胞浆,AREG阳性表达部位为细胞浆；EGFR表达与肿瘤的分化程度相关,AREG/EGFR共表达与肿瘤的分化程度相关；AREG表达和EGFR表达之间无相关性(Φ=0.039,P=0.709)；单因素生存分析结果显示,AREG表达(P=0.021,P=0.003)、TNM分期(P=0.003,P=0.001)和肿瘤分化程度(P=0.009,P=0.002)是胰腺癌患者DFS和OS预后不良的有关因素。多因素分析结果显示肿瘤分化程度(DFS HR=1.785, P=0.021; OS HR=2.125, P=0.004)是胰腺癌患者预后DFS和OS预后不良的独立影响因素。此外,AREG表达(HR=1.822, P=0.03)、TNM分期(HR=2.25,P=0.03)和手术切缘状态(HR=1.84,P=0.045)是胰腺癌患者OS预后不良的独立影响因素。(2)细胞划痕实验,细胞迁移能力实验和细胞体外侵袭实验结果显示：敲低AsPC-1细胞AREG表达能显著下调肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。Western blot及IF结果显示,敲低AREG表达使AsPC-1细胞EMT相关蛋白表达水平发生改变,包括E-cadherin和ZO-1表达水平上升,Vimentin及β-catenin的表达水平下降,EMT相关转录因子Snai、Slug和ZEB1的表达水平水平下调；MMP/TIMP蛋白芯片结果显示,AREG对胰腺癌多种MMP/TIMP蛋白质表达有影响,其中对MMP-9影响最显著。同时,AREG受体EGFR的磷酸化水平显著下调；敲低AREG表达能拮抗AREG/EGFR信号轴对ERK、AKT和STAT3等多条信号通路活化作用。转录因子NF-κB入核水平显著下降。上调AREG表达能够增强PANC-1细胞的迁移、侵袭能力。外源性升高AREG表达使PANC-1细胞E-Cadherin和ZO-1蛋白表达水平下调,Vimentin,β-catenin和MMP-9的蛋白表达水平上调,转录因子Snail和Slug表达增强,而ZEBl表达改变不明显；同时PANC-1细胞,AREG/EGFR信号轴可以活化ERK、AKT和STAT3信号通路,其中对ERK和AKT磷酸化水平的影响最为明显,同时能够增加PANC-1细胞NF-κB的转录入核水平,这种增强效应能够分别被PD153035和/或U1026减弱。AREG/EGFR信号轴对胰腺癌细胞迁移、侵袭和EMT效应的上调作用能够被QZN拮抗。AREG在4例原代培养PSC中可均见不同程度表达,PSC能显著增强胰腺癌细胞迁移和侵袭能力,这种对胰腺癌细胞的趋化效应不能被AREG中和抗体所拮抗。第二部分采用outgrowth法培养原代PSC,原代PSC经过SV40LT和hTERT重组慢病毒感染,嘌呤霉素连续筛选获得高表达SV40LT基因和hTERT基因的hPSC细胞株im PSC; RT-qPCR及Western blot结果显示im PSC细胞SV40LT和hTERT RNA和蛋白质表达水平高；IHC结果im PSC α-SMA和VIM染色阳性,胞浆内见棕黄色颗粒,im PSC呈典型PSC活化状态；此外,可见有极少部分细胞GFAP弱阳性表达；染色体核型分析可见,im PSC染色体总数发生改变,众数为60条；细胞生长曲线显示：im PSC组细胞呈现典型“S”形生长曲线：裸鼠成瘤实验结果显示,im PSC细胞在裸鼠体无成瘤性。结论AREG表达是胰腺癌患者OS预后不良的独立影响因素。AREG/EGFR信号轴能够促进胰腺癌细胞的迁移、侵袭和EMT效应。其机制可能为：AREG通过和受体EGFR相互结合,激活EGFR胞内区(pY1068)磷酸化,通过AREG/EGFR信号轴活化胰腺癌细胞内ERK、AKT和STAT3信号通路,上调NF-κB入核水平,继而使EMT相关转录因子Snail及Slug表达水平上调,抑制E-cadherin表达,并促使Vimentin和MMP-9表达,使胰腺癌细胞发生EMT。AREG/EGFR信号轴可能是治疗胰腺癌的潜在靶点,抑制该信号轴的激活在体外实验中能有效抑制胰腺癌的侵袭和转移。此外,我们建立一株人胰腺星形细胞永生化细胞系,此举将为胰腺星形细胞自身功能、胰腺星形细胞与胰腺癌细胞间的相互关系及胰腺癌肿瘤微环境等研究提供可靠、理想的实验模型。