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第一部分大鼠SOCS3基因重组腺病毒载体的构建及转染血管平滑肌细胞后的表达目的构建携带大鼠SOCS3基因的重组腺病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,评价其转染效果,为静脉移植物再狭窄转基因治疗的实验研究奠定基础。方法用BamHⅠ和EcoRⅠ将目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-4(带GFP标记)行双酶切;回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5a感受态;提取质粒酶切鉴定正确后测序。通过LR体外同源重组将rSOCS3表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上,将腺病毒线性化后转染HEK293细胞包装腺病毒,PCR鉴定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因。放大培养并收集病毒,TCID50法测定病毒滴度,将此病毒感染大鼠血管平滑肌细胞,荧光显微镜观察感染效率,real time-PCR及免疫印迹检测SOCS3mRNA及蛋白表达。结果rSOCS3腺病毒穿梭质粒酶切鉴定正确,测序与rSOCS3基因库中的序列完全相符,PCR鉴定pAd/PL-DEST腺病毒表达载体成功携带目的基因rSOCS3, TCID50法测定的最终滴度为2×1010pfu/mL。荧光显微镜观察此病毒感染血管平滑肌细胞的效率在80%以上,real time-PCR及免疫印迹结果显示血管平滑肌细胞中SOCS3mRNA及蛋白表达明显上调。结论成功构建携带大鼠SOCS3基因的腺病毒载体pYrAd-rSOCS3(同时构建空质粒对照病毒pYrAd-GFP),并在血管平滑肌细胞中高表达,为静脉移植物再狭窄转基因治疗的实验研究奠定了基础,具有一定的应用价值。第二部分SOCS3对大鼠移植静脉内膜增生的作用及机制目的探讨大鼠静脉移植模型中SOCS3对静脉移植物内膜增生的作用及机制。方法建立大鼠颈外静脉颈总动脉移植模型,90只大鼠随机分为三组:对照组;pYrAd-GFP转染组;pYrAd-rSOCS3转染组。每组30只,分别于术后1天、3天、1周、2周和4周获取移植静脉,每个时间点6只,同时取正常静脉作为空白对照。1天、3天、1周获取的静脉用于real time-PCR及Western blotting检测SOCS3、STAT3(仅检测蛋白)、P-STAT3(Ser727,仅检测蛋白)、IL-1β、IL-6、 MCP-1、ICAM-1、TNF-α mRNA和蛋白表达;2周和4周获取的静脉行组织切片,HE染色、EVG染色测量内膜厚度,CD68染色巨噬细胞计数,PCNA免疫组化计算血管平滑肌细胞PCNA阳性细胞数与细胞总数的比例。结果(1)与正常静脉相比,移植静脉中的IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TNF-α、 STAT3、P-STAT3及SOCS3mRNA和蛋白表达水平在术后1周内明显升高;(2)与对照组和pYrAd-GFP转染组比较,pYrAd-rSOCS3转染组术后SOCS3表达进一步上调(3天达到峰值),而STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1及TNF-a表达则明显下降,均在一周内下降至接近基线水平;(3)与对照组和pYrAd-GFP转染组比较,pYrAd-rSOCS3转染组术后2周和4周的移植静脉内膜增生明显减轻;(4)与对照组和pYrAd-GFP转染组比较,pYrAd-rSOCS3转染组术后2周和4周的移植静脉PCNA阳性百分比明显降低;(5)与对照组和pYrAd-GFP转染组比较,pYrAd-rSOCS3转染组术后2周和4周的移植静脉内膜巨噬细胞总数显减少。结论静脉移植到动脉后出现急性炎症反应,促炎细胞因子水平上升并激活JAK2/STAT3信号通路;作为这一信号通路的生理性负反馈抑制剂SOCS3的表达也同时上调。然而,诱导移植静脉过表达SOCS3可抑制JAK2/STAT3信号通路激活,下调炎症细胞因子的表达水平,减轻炎症反应,抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生,说明SOCS3在静脉移植物再狭窄病程中通过抑制JAK2/STAT3信号通路而发挥负向调节作用。第三部分SOCS3对血管平滑肌细胞炎症细胞因子表达及迁移增殖的作用及机制目的探讨SOCS3对血管平滑肌细胞炎症细胞因子表达及迁移增殖的作用及机制。方法构建大鼠SOCS3基因沉默干扰质粒SiRNA-rSOCS3和对照质粒SiRNA-control。培养大鼠血管平滑肌细胞。试验分两大组:A(上调组):对照组;PDGF-BB刺激组;PDGF-BB刺激+pYrAd-GFP转染组;PDGF-BB刺激+pYrAd-rSOCS3转染组;B(下调组):对照组;PDGF-BB组;PDGF-BB刺激+SiRNA-control转染组;PDGF-BB刺激+SiRNA-rSOCS3转染组。用SOCS3基因重组腺病毒载体(pYrAd-rSOCS3)和SOCS3基因沉默干扰质粒SiRNA-rSOCS3转染PDGF-BB刺激的大鼠动脉血管平滑肌细胞。Real time-PCR及Western Blotting检测SOCS3、STAT3(仅检测蛋白)、P-STAT3(仅检测蛋白)、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1的mRNA和蛋白表达,MTT和BrdU检测血管平滑肌细胞增殖,Transwell检测血管平滑肌细胞迁移,流式细胞术检测检测细胞周期变化。结果(1)血管平滑肌细胞经PDGF-BB刺激后,与对照组比较,SOCS3、STAT3、 P-STAT3、IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1及TNF-α基因和蛋白表达明显上调;(2)用pYrAd-rSOCS3转染血管平滑肌细胞后再用PDGF-BB刺激,与单独PDGF-BB刺激组和PDGF-BB刺激(?)+pYrAd-GFP转染组比较,SOCS3表达进一步上调,但STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1表达明显下调。用SiRNA-rSOCS3转染血管平滑肌细胞后再用PDGF-BB刺激,与单独PDGF-BB刺激组和PDGF-BB刺激+SiRNA-control转染组比较,SOCS3表达明显下调,而STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1表达上调;(3)与对照组比较,PDF-BB组中OD值、BrdU阳性细胞数、迁移至下层的细胞数及G2/M+S期细胞数比例明显增加,G0/G1期细胞数比例显著下降。(4)与PDGF-BB和PDGF-BB+pYrAd-GFP组比较,PDGF-BB+pYrAd-rSOCS3组OD值、BrdU阳性细胞数、迁移至下层的细胞数及G2/M+S期细胞数比例明显下降,Go/Gl期细胞数比例显著增加;(5)与PDGF-BB和PDGF-BB+SiRNA-control组比较,PDGF-BB+SiRNA-rSOCS3组OD值、BrdU阳性细胞数、迁移至下层的细胞数及G2/M+S期细胞数比例明显增加,Go/G1期细胞数比例显著下降。结论PDGF-BB作为血管平滑肌细胞的强刺激因子,可促进其由收缩静止表型向合成分泌表型转换。激活JAK2/STAT3信号通路,上调血管平滑肌细胞SOCS3表达通过负反馈调节JAK/STAT3信号通路,抑制STAT3的激活及磷酸化而下调炎性细胞因子表达,抑制血管平滑肌细胞迁移和生长,而下调血管平滑肌细胞SOCS3表达得到相反结果。体外实验进一步证实SOCS3在静脉移植物再狭窄发生发展中起负向调节作用,可为临床治疗静脉移植物衰败提供新思路,也为相关药物开发提供新的理论依据。