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木质纤维素是组成植物细胞壁的主要成分,是地球上储量丰富的可再生生物质资源。通过微生物分泌的纤维素酶降解及发酵产生生物燃料,这对于解决能源危机、环境污染等问题和实现可持续发展具有重要的意义。β-葡萄糖苷酶在纤维素水解过程中具有关键性作用,是纤维素酶代谢途径中的限速酶,被广泛应用于各种工业领域,如制药、食品和生物乙醇以及稀有寡糖的生产等。嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)是一种嗜热丝状子囊真菌,可产生大量植物细胞壁降解酶类,高效降解纤维素。本研究应用同源过表达技术和RNA干扰技术,研究β-葡萄糖苷酶转录调控因子BglR(β-glucosidase regulator)的功能,以及其对M.thermophila中的β-葡萄糖苷酶酶活和纤维素酶酶活以及相关纤维素酶基因表达量的影响。本论文主要内容如下:(1)过表达Mtbglr方面:本研究从嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)中克隆了Mtbglr基因全长,利用SLIC技术构建Mtbglr过表达载体,使用Mt Ppdc启动子及MtTpdc终止子将该基因进行了同源过表达,并将Mtbglr过表达载体转化嗜热毁丝霉,成功获得过表达转化子Mt8菌株。利用原生质体转化、酶活测定以及实时荧光定量PCR等技术实现Mtbglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。结果发现在各种不同碳源诱导条件下培养,Mtbglr基因对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性均具有增强作用,其中,1%玉米芯粉诱导培养条件下,Mt8的β-葡萄糖苷酶最高酶活为2.27 U/m L,野生型菌株(WT)的β-葡萄糖苷酶最高酶活为1.35 U/m L,均分别高于其它诱导条件下的β-葡萄糖苷酶酶活。同时转化子Mt8中主要纤维素酶基因bgl1,bgl2,bgl3,egl3的表达量分别是WT中的3.5,2.8,2.1,1.6倍。由此表明,过表达Mtbglr基因可以提高β-葡萄糖苷酶酶活,并且1%玉米芯粉是比较理想的诱导培养条件,同时对主要纤维素酶基因的表达有促进作用。(2)RNA干扰Mtbglr方面:本研究设计了Mtbglr基因的RNA干扰序列,使用Mt Ppdc启动子及Mt Tpdc终止子构建干扰表达盒,并将Mtbglr干扰载体转化嗜热毁丝霉,成功获得干扰转化子Mt14菌株。利用原生质体转化、酶活测定以及实时荧光定量PCR等技术实现Mtbglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。通过实验发现,1%玉米芯粉诱导培养条件下,WT的β-葡萄糖苷酶酶活在第8 d为1.31 U/m L,Mt14的酶活为0.71 U/m L,Mt14的β-葡萄糖苷酶活为WT的56%。同时,Mt14中主要纤维素酶基因bgl2,bgl3,egl1,egl3的表达量分别为WT的20%,48%,20%和59%。上述结果表明,干扰Mtbglr基因可以降低β-葡萄糖苷酶酶活,并且对主要纤维素酶基因的表达具有一定的抑制作用。综上所述,Mtbglr基因在嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控中起正调控作用,本研究为嗜热真菌纤维素酶基因调控奠定了一定的理论基础。