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目的：通过采用反转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术和分子克隆技术克隆人FasL基因片段，制备互补核糖核酸（cRNA）探针，采用原位杂交的方法观察FasL mRNA在肺癌组织细胞中的表达分布情况，并探讨其临床意义。 方法：分离健康人外周血单核细胞（PBMC），终浓度为50mM，用植物血凝素-P（PHA-P）激活15分钟，诱导FasL基因表达，用人全血总RNA提取试剂盒（QIAamp RNA Blood Mini kit）提取总RNA，特异性引物反转录制备互补脱氧核糖核酸（cDNA），聚合酶链反应扩增FasL基因片段，产物经琼脂糖凝胶电泳，显示在≈328bp处呈现1条与预期产物分子量大小相符的DNA扩增条带，按照QIAquick凝胶提取试剂盒说明进行胶上PCR产物回收，予以扩增、纯化，用PstI、EcoRI双酶切PCR产物和质粒pSPT19，使PCR产物和质粒DNA两端互补，用T4连接酶将其定向克隆入质粒中，转化感受态大肠杆菌JM109，在涂抹有氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白筛选，获取有重组质粒的阳性转化子，插入的FasL cDNA经DAN测序证实与Genebank中FasL序列相同，用PstI酶酶切重组质粒，使之线性化，经SP6聚合酶体外转录制备地高辛标记的FasL cRNA探针（Dig-FasL cRNA）。收集青岛大学医学院附属医院胸外科手术切除的肺癌新鲜标本（经病理证实，其中鳞状细胞癌3例，腺癌2例，小细胞癌1例），置于无菌Ep管中，经液氮速冻运输，转移至-70℃冰箱中备用，标本经4％多聚甲醛和15％蔗糖处理后制备成冰冻切片，厚度为6μm，再经多聚甲醛后固定，非离子型去污剂处理细胞膜，在切片上用cRNA探针进行原位杂交，经四唑氮蓝（NBT／BCIP）显色，镜下观察FasLmRNA在肺癌细胞中的表达分布情况。 结果：DNA测序证实重组质粒中插入的FasL cDNA序列准确无误；地高辛标记的FasL cRNA探针经标记效率检测，标记效率满意；镜下观察发现三种病理类型的肺癌细胞胞浆中均可检测到蓝紫色杂交信号，表明肺癌细胞中存在FasL mRNA的表达。第一章中文摘要 结论:FasL基因的克隆化成为肺癌细胞凋亡研究的工具;地高辛标记的FasL mRNA探针为进一步研究FasL mRNA在肺癌细胞中的表达分布提供了有效手段:FasL作为促细胞凋亡基因与肺癌的发生、发展有重要关系。