前言Connexin 26 (Cx26)是细胞间隙连接蛋白(connexin, Cx)家族中分子量最小的蛋白,Cx属于多基因家族,目前从脊椎动物组织中至少已分离克隆出20种Cx基因,这一家族基因合成的蛋白属于跨膜蛋白,并依据蛋白质分子量对各成员进行命名,如Cx26、Cx32等。这类跨膜蛋白是构成细胞间间隙连接通道(GJs)亚单位的结构基础,即连接子(由6个Cx蛋白构成的半通道),相邻细胞膜上的两个连接子组成一个完整的GJ,负责细胞间分子量小于1KD的分子和离子的交换和传递,包括第二信使。由GJs介导的间隙连接细胞间通讯(GJIC)对细胞增殖、分化及机体的生长发育至关重要,是维持机体组织器官正常结构及功能和内环境稳定的基础。近年来研究发现,Cxs的异常表达与多数肿瘤的发生和发展密切相关,被学者们誉为一类新的抑癌基因。与其他成员类似,Cx26亦被认为是有抑制肿瘤生长的作用,然而其表达水平和生物学效应却更为复杂。Kanczuga-Koda L通过免疫组化法证实了结直肠癌在发生过程中Cx26表达缺失,并伴有表达定位从胞膜到胞质的改变。相反,另外一些研究证明Cx26在某些肿瘤中过度表达,如前列腺癌和皮肤癌。最近亦有报道称Cx26受某些生长因子的调节,间接调控细胞的生长和凋亡。因此,Cx26在肿瘤中的表达及在肿瘤发生和发展中的作用并无统一定论,有待进一步研究。目前,Cx26在胃癌中的表达情况还未见报道,我们以大量临床手术切除样本做为研究对象,应用免疫组化S-P法首次对人胃癌石蜡包埋标本中Cx26蛋白的表达进行检测,并用Realtime PCR和Western blot方法检测新鲜胃癌及正常胃组织中Cx26表达及转录情况,运用统计学方法分析Cx26的表达与患者临床病理学指标的相互关系,包括生存分析；同时我们使用pcDNA3.1-CFP-Cx26真核表达质粒,瞬时转染人低分化胃癌细胞株MGC-803,观察了Cx26过表达对胃癌细胞生长的影响,并初步研究了Cx26对人胃癌细胞生长和凋亡调控作用的机制。该研究对了解肿瘤的生物学特性具有明显的理论意义,而且也具有一定临床价值和社会效益。第一部分Cx26在胃癌组织中的表达和与临床病理学指标的相关性及预后分析目的检测人胃癌组织石蜡包埋及新鲜标本中Cx26的表达,并统计分析Cx26表达与患者临床病理学指标的相关性,包括生存分析。方法收集213例临床资料完整的人胃癌根治术切除的石蜡包埋组织标本以及20例新鲜胃癌及对应正常胃组织标本。应用免疫组化S-P法检测石蜡包埋标本中Cx26蛋白的表达,Realtime PCR和Western blot方法检测新鲜胃癌及正常胃组织中Cx26表达及转录情况,用统计分析软件评价Cx26表达与患者临床病理学指标和预后的相关性。结果在10个高倍显微镜(×400)视野下计数阳性细胞的百分率,阳性细胞数的百分率<10%判定为阴性,阳性细胞数百分率≥10%判定为阳性。205例人胃癌石蜡组织标本中Cx26阳性率为38.5%。在部分正常胃黏膜固有层腺上皮细胞中,偶可见Cx26呈颗粒状表达于胞膜,而癌细胞中Cx26呈弥漫状分布于胞质。Cx26的表达与多数临床病理学指标呈负相关,包括病理学分型、浸润深度、淋巴结转移、临床分期、淋巴管和血管浸润级别以及10年累积生存率。Cx26的表达与肠型胃癌(Laruen’s分类标准)密切相关(P=0.0017)。多因素生存分析结果显示在肠型胃癌中,Cx26可作为一个独立的预后较好的指标(P=0.023,HR=2.019)。RealtimePCR和Western blot法检测新鲜胃癌组织中Cx26表达与免疫组化法检测胃癌石蜡组织标本的结果基本一致。结论在胃癌组织,胞质Cx26的高表达在胃癌发生发展中可能有抑制肿瘤生长的作用,且在肠型胃癌中Cx26可作为评价预后的一个指标。第二部分Cx26过表达对MGC-803细胞生长和凋亡的影响及相关机制的初步研究目的观察Cx26基因对MGC-803细胞生长和凋亡的调控作用,初步探索其相关机制。方法采用pcDNA3.1-CFP-Cx26真核表达质粒瞬时转染人低分化胃癌细胞株MGC-803,应用MTT细胞生长曲线法、流式细胞仪检测细胞的生长、凋亡和增殖,应用Western blot的方法检测凋亡相关蛋白Fas、Fas-L、DR5、Bax、Bcl-2、Bcl-xLcaspase-3,细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinases inhibitory proteins, CKIs) p21、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)以及胰岛素样生长因子Ⅰ型受体IGF-IR蛋白的表达。结果转染pcDNA3.1-CFP-Cx26质粒后的MGC-803细胞,其生长速度明显减慢,与未转染组和空载转染组比较,在第九天时,分别下降68%和67%。流式细胞仪结果显示Cx26高表达能促使MGC-803细胞凋亡率增加,能使多数细胞停滞在G2／M期。促凋亡蛋白Fas、Fas-L、Bax表达升高,而抑制凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达降低,具有活性的caspase-3蛋白表达增加。p21和PCNA的蛋白表达没有变化。另外,胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)表达量随Cx26表达量的增加而增加。结论Cx26基因过表达能够明显抑制MGC-803细胞的生长,其作用与该基因蛋白促进细胞凋亡密切有关,同时也可能与诱导胰岛素样生长因子受体表达增加有关。