哺乳类动物心室肌细胞延迟整流钾电流包括快、慢激活两种成分,其中负责快激活成分IKr的通道孔区亚单位由hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因编码,hERG通道的激活引发动作电位3期复极的开始,对心肌的复极化有重要作用。h ERG基因突变是引发离子通道病的遗传分子基础。此外,疾病状态下,如高血压、冠心病、心肌缺血等引发的心肌肥厚和心衰以及糖尿病等,均伴有IKr下调,是造成获得性LQT综合征的重要原因。越来越多的证据表明,同其它细胞功能一样,磷酸化是调节hERG通道功能进而影响心肌电生理特性的有效方式,其中催化磷酸化反应的蛋白磷酸激酶C(protein kinase C,PKC)家族对hERG通道的调控备受关注。PKC依据它们的结构和激活的机制分为3类:即传统型PKC(cPKC,包括α、βI、βII和γ),为Ca2+依赖性的,被二脂酰甘油(DAG)、磷脂酰丝氨酸(PS)激活;新型PKC(nPKC,包括δ、ε、π和θ),为非Ca2+依赖性,被DAG和PS激活;非典型PKC(aPKC,包括ζ、?/λ),为非Ca2+依赖性,被PS激活。已知心肌细胞存在多种PKC亚型,可催化膜离子通道蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化,是神经体液因素调控通道功能的关键中介物。实验显示,缺血缺氧、血管紧张素II、氧化应激(H2O2)等不同病理刺激可激活心肌不同的PKC亚型,而不同PKC亚型可能对离子通道发挥不同的调节作用,如Makary等发现不同的PKC亚型对乙酰胆碱激活的K+通道存在激活与抑制两种不同的调控作用。有研究表明,?1A肾上腺素受体激活对hERG钾通道呈现急性下调作用,我们的前期研究发现Ang II激动AT1受体同样对hERG通道发挥急性抑制作用。AT1受体与?1A肾上腺素受体同属于Gq蛋白偶联受体,而PKC是受体激活后调控通道的主要中介分子。然而,二者对通道抑制的方式表现不同,激动?1A肾上腺素受体使通道激活曲线右移,而AT1受体激动并不影响通道的电压依赖性激活。由此我们推测,两种不同的Gq蛋白偶联受体可能通过不同的PKC亚型对通道发挥抑制作用。为验证以上假设,本研究主要采用全细胞膜片钳技术和westernblot技术,探索?1a肾上腺素受体激动剂a61603对豚鼠心室肌细胞以及异源表达系统hek293细胞上ikr/herg电流的影响。利用pkc亚型选择性抑制剂(抑制肽)以及激活肽,分析其中介的pkc亚型,并同angii对herg通道的调控作用相对比。同时利用磷酸化位点突变通道分析不同pkc亚型对通道调控的分子机制。第一部分?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制心室肌细胞ikr目的:观察选择性?1a肾上腺素受体激动剂a61603对成年豚鼠心室肌细胞快激活延迟整钾电流ikr的影响,分析中介其作用的pkc亚型。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,全细胞膜片钳技术记录ikr,观察a61603对电流影响。结果:(1)a61603以浓度依赖的方式抑制ikr,ic50是300nm。在激活电压为+40mv时,a61603(1μm)作用10分钟ikr电流密度由对照组的0.93±0.04pa/pf下降至0.62±0.07pa/pf(p<0.01)。(2)选择性?1a肾上腺素受体抑制剂wb4101,以及pkc非选择性抑制剂bis-1明显减弱a61603对ikr的抑制作用,而pka非选择性抑制剂h89对其作用无显著影响。表明a61603激动?1a肾上腺素受体主要通过pkc途径抑制ikr。(3)pkc选择性抑制剂g?6976(抑制pkc?,?,?)与g?6983(抑制pkc?,?,?,δ,ζ)以及pkc?选择性抑制肽?c2-4明显减弱a61603对ikr的抑制作用,特异性pkcε抑制肽εv1-2无此作用。表明a61603激动?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制ikr。小结:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,a61603激动?1a肾上腺素受体对ikr产生急性抑制作用,这种抑制作用主要由pkc?介导。第二部分不同pkc亚型对herg电流的调节作用目的:在异源表达系统hek293细胞上研究pkc亚型激活肽对herg电流的作用,同时验证?1a肾上腺素受体激动对herg电流的调控作用,进一步验证?1a肾上腺素受体激动通过pkc?亚型抑制herg电流。方法:在共表达herg和人?1a肾上腺素受体基因的hek293细胞上,全细胞膜片钳技术记录herg电流,观察a61603及pkc亚型激活肽对电流影响,其中a61603为细胞外灌流给药方式,而pkc亚型激活肽采用细胞内电极内液给药方式。结果:(1)cpkc激活肽(cpkc-ap)与pkcε激活肽(ε-ap)均急性抑制herg电流。cpkc-ap对herg通道的半数激活电压v1/2由对照组的-18.6mv右移至-9.5mv(p<0.01),而ε-ap并未影响通道v1/2(p>0.05)。cpkc-ap与ε-ap降低通道电导率gmax分别降至对照组的56.8%与80.6%。(2)a61603急性抑制herg电流,半数激活电压v1/2由对照组的-16.9mv右移至-11.8mv(p<0.01),通道电导率gmax降低为对照组的70.8%,a61603对herg电流的影响与cpkc-ap的作用相近。(3)cpkc-ap减慢各去极化电压下herg通道的激活,ε-ap减慢去极化至0mv与20mv电压下herg通道的激活,对去极化至40mv与60mv电压下herg通道的激活无影响;cpkc-ap减慢herg通道的去活,ε-ap使herg通道的缓慢去活时间常数降低,快速去活时间常数无变化;cpkc-ap与ε-ap对herg电流的稳态失活与恢复均无影响。小结:在异源表达系统hek293细胞上,cpkc激活肽与pkcε激活肽对herg通道呈现不同的抑制方式。a61603急性抑制herg电流并使得v1/2右移且gmax下降,此作用与cpkc激活肽相似,进一步提示a61603激动?1a肾上腺素受体通过cpkc亚型抑制ikr。第三部分?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制ikr/herg电流的机制目的:观察?1a肾上腺素受体激动对pkc亚型激活的影响,以及不同pkc亚型调节herg通道的分子机制。方法:在急性分离豚鼠心室肌细胞上,?1a肾上腺素受体激动剂a61603急性作用10分钟后,提取全细胞蛋白,采用pkcα与pkcε的磷酸化抗体做westernblot,以磷酸化pkc亚型蛋白含量的变化反映激动?1a受体对pkc亚型的选择性激活作用。在共表达herg-?pkc(将herg通道中18个潜在pkc磷酸化位点中除t74外的17个丝氨酸/苏氨酸突变)和人?1a肾上腺素受体基因的hek293细胞上,全细胞膜片钳技术记录herg电流,观察a61603及pkc亚型激活肽对电流影响,探究?1a肾上腺素受体激动抑制ikr/herg电流的分子机制。其中a61603采用细胞外灌流给药方式,而pkc亚型激活肽采用细胞内电极内液给药方式。结果:(1)a61603作用10分钟后使得豚鼠心室肌细胞p-pkcα亚型表达量增加至对照的2.72±0.25倍(p<0.01),而p-pkc?亚型无显著变化(p>0.05),表明?1a肾上腺素受体激动选择性激活pkcα亚型。(2)在瞬转突变通道的hek293细胞上,cpkc激活肽急性抑制herg-?pkc电流,pkcε激活肽对herg-?pkc电流无影响,两种亚型激活肽均未影响herg-?pkc电流的半数激活电压v1/2。(3)激活电压为0mv时,cpkc激活肽对herg-?pkc和herg-wt的尾电流与对照组相比分别降低39.3%与37.4%,电流抑制率无显著差异,gmax亦无统计学差异,表明cpkc激活对通道的下调作用与17个磷酸化位点关系不大,可能通过直接磷酸化t74位点或者其它非直接磷酸化途径实现;pkcε激活肽对herg-wt通道电流抑制率为29.3%,但对herg-?pkc尾电流几乎无影响,即通道磷酸化突变几乎取消了pkcε激活肽的作用,提示pkcε激活肽通过通道磷酸化调控通道功能。(4)a61603急性抑制herg-?pkc电流,激活电压为0mv时,电流密度抑制率为31.8%,与其对herg-wt尾电流的抑制率28.4%无统计学差异。表明当herg钾通道的17个pkc磷酸化位点突变后,a61603对通道尾电流的抑制作用依然存在,此作用与cpkc激活肽对通道作用相似。尽管理论上cpkc激活肽可激活包括α、βi、βii以及γ等在内的传统pkc亚型,由于pkcα介导a61603的作用,cpkc激活肽与a61603对通道呈现相似的调控方式提示cpkc激活肽主要激活pkcα。小结:?1a肾上腺素受体激动选择性激活pkcα亚型。pkcα和pkcε亚型通过不同的分子途径调控herg通道:pkcα可能通过直接磷酸化t74位点或者其它非直接磷酸化途径下调herg通道功能,而pkcε通过对herg通道的直接磷酸化抑制电流。结论:1在急性分离的豚鼠心室肌细胞和异源表达系统上,?1a肾上腺素受体激动剂a61603对ikr/herg电流呈现浓度依赖性抑制,此作用由pkcα亚型中介。2激动?1a肾上腺素受体可选择性激活pkcα亚型。3pkcα和pkcε亚型通过不同的分子途径调控herg通道:前者可能通过磷酸化t74位点或非通道磷酸化途径而急性抑制herg电流,而pkcε通过对hERG通道的直接磷酸化使Gmax降低而急性抑制电流。