【摘 要】
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目的 在筛选出的杂交瘤细胞的基础上制备、纯化及鉴定重组人14-3-3(rh14-3-3)蛋白zeta亚型单克隆抗体(McAb),并探讨14-3-3蛋白在人体组织器官的分布以及对患者脑脊液中14-3-3
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目的 在筛选出的杂交瘤细胞的基础上制备、纯化及鉴定重组人14-3-3(rh14-3-3)蛋白zeta亚型单克隆抗体(McAb),并探讨14-3-3蛋白在人体组织器官的分布以及对患者脑脊液中14-3-3蛋白的检测。方法将分泌抗人14-3-3蛋白zeta亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔,抽取腹水,用辛酸—饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体,再用SDS-PAGE鉴定其纯度和Bradford法测定其浓度;切胶、电洗脱纯化重组的人14-3-3zeta亚型蛋白,利用该抗原通过ELISA测定单克隆抗体的效价,抗体亚型鉴定按照试剂盒操作进行,通过Western-blot与人、兔和鼠脑组织蛋白提取液以及重组的日本血吸虫14-3-3(rSj14-3-3)、刚地弓形虫14-3-3(rTox14-3-3)蛋白进行免疫识别,鉴定其特异性和交叉反应,免疫组化鉴定其与内源性人14-3-3的亲和力及亚细胞定位,最后用此抗体检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布以及患者脑脊液中14-3-3蛋白的检测。结果 腹水及纯化后的单克隆抗体的效价分别为1:10~7和1:10~6,纯化后的单克隆抗体纯度超过96%,浓度为5mg/ml,其抗体亚类为IgG1,能够识别天然的内源性人14-3-3蛋白,并能够有效的识别兔和鼠脑组织的14-3-3蛋白,在试验的人脑、肾、肺、肝、胃、卵巢、乳腺、结肠、胰腺等组织器官,均检出有14-3-3蛋白。但是在280例神经系统疾病患者的脑脊液标本中,均没有检测出14-3-3 zeta亚型。结论 成功制备出重组人14-3-3 zeta亚型单克隆抗体,并将其初步应用于探讨14-3-3蛋白在人体组织器官的分布以及患者脑脊液中14-3-3蛋白的检测,为研究14-3-3蛋白在机体生理和病理情况
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