论文部分内容阅读
研究目的:1.通过体内动物实验观察高糖对大鼠肾脏的的损伤情况及大黄素（Emodin,EMO）对肾脏的保护作用,主要通过监测各组大鼠的状态、肾脏功能及肾脏病理等多方面表现进行评价;2.通过体内动物实验监测高糖环境下各组大鼠足细胞上皮间质转分化（Epithelialmesenchymal transition,EMT）标志物肾病蛋白（Nephrin）、足细胞EMT骨架蛋白（Desmin）的相对表达情况,探讨大黄素、高糖及足细胞EMT之间的关系;3.通过体内动物实验监测各组大鼠肾脏组织中整合素连接激酶（Integrin linked kinase,ILK）及P38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinasep,P38MAPK）的相对表达情况,探讨大黄素、ILK-P38MAPK信号通路与EMT之间的关系;4.探讨大黄素对糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）足细胞的保护作用及机制研究。研究方法:1.糖尿病肾病大鼠模型的建立及干预措施:本实验选用8-10周龄健康雄性（sprague-dawley,SD）大鼠40只,适应性喂养1周后开展后续实验。40只大鼠按数字表法随机分为正常组（NC组,n=10）和实验组（n=30）,实验组予高糖、高脂饮食联合一次性腹腔内注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）40mg/kg建立DM大鼠模型,DM成模后继续观察,当大鼠24小时尿蛋白（24-hour urine protein,24h Upro）水平达到30 mg,为早期DKD模型复制成功。DKD成膜24只,24只大鼠按数字表法随机分为糖尿病肾病组（DKD组,n=12）和大黄素治疗组（DKD+EMO组,n=12）,DKD组大鼠继续予高糖、高脂饮食,DKD+EMO组大鼠予高糖、高脂饮食联合大黄素灌胃（20mg/kg/d）,连续8周,期间观察大鼠状态。2.大黄素对DKD大鼠足细胞的保护作用及机制研究:实验期间观察各组大鼠状态,15周末,收集大鼠24小时尿液,记录大鼠体重。血清检测肾肌酐（Serum creatinine,Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）及血糖（Blood glucose,BG）,尿液检测大鼠24h Upro,通过以上指标评价大鼠肾脏功能。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin and eosin stain,HE）观察各组大鼠肾脏组织形态学变化;过碘希夫酸染色法（Periodic acid-schiff stain,PAS）观察各组大鼠肾小球毛细血管袢、系膜基质变化情况;透射电镜观察足细胞及肾小球基底膜（Glomerular basement membrane,GBM）等超微结构变化情况。免疫组化及免疫印迹法检测大鼠肾脏组织中ILK、P38MAPK、Nephrin及Desmin的表达情况,基于以上相关检测指标,探究大黄素对DKD大鼠足细胞的保护作用及机制。结果:1.一般情况:NC组大鼠饮食饮水量、活动量、精神状态、毛色光泽度及大小便均未见异常,15周末体重（350.10±14.16）g;与NC组相比,DKD组大鼠饮食饮水量明显增多、活动量减少、精神状态差、眼神呆滞、毛发稀疏、光泽度差、小便增多、大便稀,15周末体重（265.2.±7.62）g;经大黄素治疗后,DKD+EMO组大鼠饮食饮水量无明显变化、活动量逐渐增加、精神状态好转、小便较多、大便稀,15周末体重（312.1±11.77）g。2.大鼠肾脏功能检测结果:与NC组相比,DKD组大鼠Scr、BUN、BG及24h Upro均显著升高,肾脏功能损伤情况严重,差异具有统计学意义（P＜0.001）;经大黄素治疗后,DKD+EMO组大鼠Scr、BUN、BG及24h Upro较DKD组明显下降,肾脏功能损伤情况明显改善,差异具有统计学意义（P＜0.001）。3.肾脏组织大体结构观察:NC组大鼠肾脏大小正常、表面光滑、色红润、纵行剖开可见皮髓质界限清晰;DKD组大鼠肾脏增大、表面粗糙、色苍白、纵行剖开可见皮髓质界限不清;经大黄素治疗后,DKD+EMO组大鼠以上情况均有好转。4.大鼠肾脏组织HE及PAS染色结果:NC组大鼠肾小球大小正常,肾小管组织结构清晰;DKD组大鼠肾组织结构紊乱,肾小球硬化、毛细血管袢模糊不清,系膜基质明显增多,肾小囊狭窄、可见部分肾小管上皮细胞空泡变性;经大黄素治疗后,DKD+EMO组大鼠肾脏组织损伤情况明显改善,肾小球组织结构较清晰,毛细血管袢结构较模糊,系膜基质略增多,肾小球硬化减轻。5.透射电镜观察足细胞和肾小球基底膜变化情况:NC组大鼠足细胞无水肿,足突均匀、等宽排列、未见融合,GBM完整、厚薄均一,血管腔未见萎缩、塌陷及红细胞聚集,线粒体未见肿胀;DKD组大鼠足细胞呈中度水肿,可见大量足突融合、变宽,GBM增厚,血管腔内见大量红细胞聚集,肾淤血,线粒体明显肿胀;经大黄素治疗后,DKD+EMO组大鼠足细胞呈轻度水肿,少量足突融合,GBM轻度增厚,血管腔未见明显萎缩、塌陷及红细胞聚集,线粒体轻度肿胀。6.免疫组化及免疫印迹检测肾组织中ILK、P38MAPK、Nephrin及Desmin水平变化情况:DKD组大鼠ILK、P38MAPK及Desmin较NC组升高,Nephrin较NC组下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;经大黄素治疗后,DKD+EMO组大鼠ILK、P38MAPK及Desmin较DKD组下降,Nephrin较DKD组升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:持续高糖状态可诱导足细胞发生EMT,引起足细胞损伤,导致肾脏结构及功能发生改变;大黄素通过抑制足细胞EMT的发生,保护肾小球滤过膜完整,改善肾脏的结构和功能,其机制可能与调控ILK-P38MAPK信号通路密切相关。