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β-1，3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)是一种有重要经济价值的工业用酶，已应用于酿酒和饲料工业，近年在生物防治方面也有研究报道。本研究主要对来源于多粘类芽孢杆菌CP7菌株的β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因进行了克隆，并在原核与真核系统进行表达，探索了重组酶的酶学性质，为该酶在生物防治以及饲料工业方面的应用提供理论依据，获得的主要结果如下：
1.在发酵种子培养基基础上，用梯度筛选法对CP7菌株产β-1，3-1,4-葡聚糖酶的培养基及培养条件进行了优化。结果表明，CP7菌株适宜产B-1，3-1,4-葡聚糖酶的培养基中，以碳源比例占4.5％，氮源占3％时效果较好。以优化的培养基比例进行发酵培养的条件为：振荡速度150r/min，培养基起始pH5.0～6.O，发酵时间约48h。在上述条件下，可获得天然菌株CP7最高产量的β-1，3-1,4-葡聚糖酶。
2.根据已报道的β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因序列信息设计引物，经PCR扩增获得一条特异的DNA片段，采用T载体克隆了CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因。利用生物信息学技术分析该基因，序列开放阅读框(ORF)全长717bp，编码238个氨基酸，含有糖基水解酶F16家族的保守序列EIDIEF。分子量为27kDa，等电点为7.32。前26个氨基酸为信号肽序列，成熟肽片段由212个氨基酸组成，编码序列为636bp，理论分子量24kDa，等电点为5.96。此序列已在GenBank上登录，登录号为EU328344。
通过同源性比较，CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因与已登录来自其它细菌该酶基因序列的同源性最高达98％，氨基酸序列同源性最高为100％；系统进化树显示CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因与其它同属多粘芽孢杆菌类来源的酶基因亲缘关系最近，与非多粘芽孢杆菌种属来源的基因亲缘关系稍远；通过密码子偏爱性分析软件分析，CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因含有的稀有密码子和稀有密码子串联量相对较少。
3.将CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因插入到pET-21d(+)载体中构建了重组表达载体，通过IPTG诱导，成功实现了目的基因在大肠杆菌BL 21(DE3)中的异源表达。CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶工程菌株，用1 mM IPTG的诱导剂浓度、在菌液起始OD600 0.6～0.8之间时开始诱导培养，经过3h培养，此时目的蛋白表达量最大。经BandScan软件分析，目的蛋白表达量占总蛋白量的最高值为60.4％，主要以不溶性的包涵体形式存在。 4.利用表达载体上带有的6个聚组氨酸标签对重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶包涵体表达产物在变性的条件下进行了亲和纯化并透析复性，用含有地衣多糖的LB平板检测到表达产物复性后具有β-1，3-1,4-葡聚糖酶活性，采用DNS还原糖测定法测定了复性后酶蛋白活性为24.55U/mL。
重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶工程菌，分泌的目的蛋白可以实现部分可溶性表达的条件是诱导剂(IPTG)的浓度为0.02mM，18℃时培养12h。在表达产物中，上清中可溶性目的蛋白占总蛋白量的58.5％，沉淀中的目的蛋白表达量由60.4％减少至总蛋白量的27.7％。检测工程菌菌体内总酶活可达53.27U/mL；经纯化后总酶活为50.88U/mL，比包涵体表达形式的酶活提高了2倍多。
5.根据CP7菌β-1，3-1,4-葡聚糖酶核苷酸序列测定结果，设计了针对毕赤酵母表达载体专用的表达引物，将目的基因亚克隆后构建重组表达载体经线性化后电击转化野生型毕赤酵母X-33，利用MM、MD平板筛选得到甲醇利用型重组酵母，将经基因组PCR鉴定为阳性重组酵母的菌株进行甲醇诱导表达，SDS-PAGE检测，证明目的蛋白在毕赤酵母中成功实现了分泌性表达。经分析测定，表达上清中重组酶占表达总蛋白量的16.2％，酶活为2.86U/mL。
6.利用平板对峙培养法以及生长速率测定法，检测重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Sch1.f.sp.cubense)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、荔枝炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)以及出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的抗真菌活性，对四种真菌菌丝生长的抑制率分别为：荔枝炭疽41.03％、香蕉炭疽53.85％、出芽短梗霉57.89％、尖孢镰刀菌61.22％。结果表明，重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶对四种供试真菌均表现出抑制活性，且对不同种的真菌菌丝生长抑制效果存在一定的差异性。
7.利用人工肠液和人工胃液模拟动物消化系统，探讨了重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶在降低麦类饲料黏度方面的作用。结果发现，添加重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶终浓度为0.025％的处理组样品，经消化后平均黏度比对照组降低了4.69％，试验表明重组β-1，3-1,4-葡聚糖酶能有降低麦类饲料的黏度，提高饲料消化率。