戊型肝炎病毒(HEV)为无包膜正二十面体单链正义RNA病毒,主要经粪口途径传播,往往在发展中国家造成爆发流行,在发达国家导致散发流行。戊型肝炎的病死率为0.2-4%,孕妇病死率则高达10-20%,且越来越多的证据表明其可能是一种人兽共患病,给人类身体健康造成极大的危害。HEV由于一直缺乏稳定有效的细胞感染模型,其感染入胞机制及其致病机理至今仍不清楚。本论文利用能较好模拟HEV表面结构的HEV衣壳蛋白片段p239为模型,构建p239相互作用蛋白筛选平台,筛选可能参与HEV入胞过程的宿主细胞蛋白,为揭示HEV感染入胞机制提供线索。p239为HEV pORF2(aa368-606)片段,原核表达能自组装成15-30nm的蛋白颗粒,与戊型肝炎患者急性期血清反应性良好,免疫恒河猴可以完全预防HEV导致的戊型肝炎。p239孵育HepG2细胞,能特异性的吸附并侵入细胞,且被p239中和单抗8C11阻断。p239与野生1型HEV共孵育细胞,能阻断HEV感染HepG2和人原代肝细胞,表明p239能较好模拟HEV表面结构。利用p239较好模拟HEV表面结构的特性,将其作为蛋白亲合层析的配体/诱饵蛋白,借助钙调蛋白结合肽(Calmodulin binding peptide,CBP)与钙调蛋白的特异性结合将其固定于琼脂糖固相介质,亲合层析体外筛选HepG2细胞、猴肝组织中与其相互作用的蛋白,获得的候选蛋白样品采用二维电泳进行分离,挖取特异的候选蛋白点,胶内原位酶切, MALDI-TOF-MS分析鉴定,确定六个候选蛋白:Grp78、HSP90、α-tubulin、p43、ATPase beta subunit、unamed protein。免疫共沉淀初步确定p239与Grp78、HSP90、α-tubulin之间的特异性相互作用。有研究发现Grp78分布于细胞膜表面参与柯萨奇病毒、登革热病毒的入胞。为了进一步研究p239与Grp78的相互作用,原核表达、纯化p239、Grp78,免疫共沉淀实验发现二者之间的特异性相互作用为直接结合,且原核表达纯化的Grp78-his pull down实验进一步佐证了二者的直接相互作用,还发现ATP可以解离二者的结合,这一系列证据充分说明二者的结合是直接的、可逆的生理性结合。将p239的C端缺失6个氨基酸得到p233,p233并不与Grp78结合,表明p239通过构象位点与Grp78结合。中和抗体8C11阻断结合实验发现二者的结合位点与p239的主要免疫优势表位8C11存在区域重叠。流式细胞仪检测发现Grp78同样存在于HepG2细胞表面;激光共聚焦显微镜发现p239与HepG2细胞膜表面的Grp78存在部分共定位;且原核表达纯化的Grp78、Grp78-his以及抗Grp78鼠多抗血清都能部分阻断p239对宿主细胞的吸附。综上所述,我们得出以下结论:1.p239可以吸附并侵入宿主细胞,这种吸附可以被8C11特异性阻断;且p239竞争性抑制HEV对HepG2及人原代肝细胞的感染,表明p239较好的模拟HEV表面结构,可以作为HEV模型用于病毒与宿主细胞相互作用研究。2.以p239-CBP为诱饵蛋白筛选宿主细胞中的相互作用蛋白,获得Grp78、HSP90、α-tubulin、p43、ATPase beta subunit、unamed protein六个候选蛋白,免疫共沉淀初步确定p239与Grp78、HSP90、α-tubulin之间的特异性相互作用,表明以p239为靶蛋白的相互作用蛋白筛选平台具有可行性。3.原核表达纯化的Grp78、Grp78-his以及抗Grp78鼠多抗血清都能部分阻断p239对宿主细胞的吸附作用,充分表明HepG2细胞膜蛋白Grp78参与并介导HEV衣壳蛋白片段p239对宿主细胞的吸附。本研究为HEV感染入胞机制的研究提供了线索,为进一步的抗HEV病毒药物的开发和疫苗设计提供了理论依据。