研究目的:随着糖尿病在国内外发病率的逐渐升高,糖尿病急慢性并发症发生机会明显增加。糖尿病患者患心脏病或中风的风险是非糖尿病患者2-4倍。二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂作为一类新降糖药物,具有双向调节胰岛β功能,降糖疗效确切,低血糖发生率低。糖尿病患者的高血糖和高游离脂肪酸使β-细胞功能逐渐恶化,加重血糖及游离脂肪酸紊乱,导致恶性循环,加快动脉粥样硬化进程,诱发心脑血管事件。DPP-4抑制剂降低血糖作用明确,并可以保护β细胞功能。目前研究表明,DPP-4抑制剂可能具有心脑血管保护作用,推测可能的为作用机制:改善血脂,阻断单核细胞的活化/趋化作用,阻止单核细胞的迁移和肌动蛋白聚合,从而减少内脏脂肪组织、巨噬细胞含量和炎症,从而发挥抗动脉粥样硬化作用。作为DDP-4抑制剂之一,维格列汀增加β细胞分泌的胰岛素,有效降糖。作为降糖药物使用过程中,维格列汀可通过减少空腹脂解和载脂蛋白B-48,减少肠道中的油脂分泌并在进餐时动员并燃烧脂肪;显著降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)的水平。此外,用于合并非酒精性脂肪肝发生血脂异常的患者时,维格列汀可显著改善体重、体重指数(BMI)、TC、TG和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。由于非高密度脂蛋白胆固醇,尤其是低密度脂蛋白胆固醇,以及甘油三酯均是心脑血管事件的危险因素,我们认为探讨维格列汀在肝脏脂质代谢中的作用是必要。目前大多数研究者未明确维格列汀调节脂质代谢作用是否与GLP-1相关,需要严密设计的体内和体外研究进一步探讨。在本研究中,我们采用小鼠模型和HepG2细胞模型来确定维格列汀是否可以改善肝脏脂质,并尝试探索维格列汀治疗对脂质代谢所涉及的可能机制。研究方法:1.动物实验:6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自北京维通利华公司,饲养于清洁环境,控制光照(12小时光照和黑暗交),室内温度维持在22-23℃。饲料均购自北京科奥协力饲料有限公司,普通饲料为100%基础饲料,14.09 KJ/g;高脂饲料热卡为17.05 KJ/g,配方为82.7%基础饲料+2%胆固醇+15%猪油+0.3%胆酸钠。维格列汀来自诺华,用双蒸水中溶解混匀,按照50mg/kg.d灌胃处理。未应用维格列汀处理小鼠作为匹配对照给予双蒸水10ml/kg.d灌胃处理。小鼠适应性饲养1周后根据实验设计分别给予普通饮食、高脂饮食及高脂饮食联合维格列汀喂养20周。处死前禁食不禁水8 h,麻醉后经眼球取血后离心保存;肝脏一部分经液氮冻存后续使用,一部分4%多聚甲醛固定后用于形态学检查。2.细胞实验本课题细胞实验应用与肝细胞具有相同生物学活性的HepG2细胞,购自(上海)典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养使用MEM培养基,使用前添加10%胎牛血清(FBS),1%谷氨酰胺(GIBICO),100 U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素配制成细胞完全培养基。细胞处理试剂维格列汀诺华公司提供;艾塞那肽(GLP-1)购自美仑生物。Western Blotting 使用兔抗 HMGCR、CYP7A1、LDLR、SR-B1、ACAT2 购自Abcam;鼠抗GAPDH购自武汉三鹰;小鼠二抗及兔二抗均购自Jackson。游离胆固醇(#E1016)、总胆固醇(#E1015)检测试剂盒均购自普利莱公司。细胞总游离胆固醇菲律宾(FIL1PIN)荧光染色试剂盒购自GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A(GMS80059.1 v.A)。结果:1.处理组喂养小鼠的体重增长适应性饲养后,小鼠分别经过12周普通饮食、高脂饮食及高脂饮食联合维格列汀饲养后,小鼠体重均有明显增加(分别为20.75±0.50g VS 24.08±0.49g,20.70±1.43 VS 29.81±3.08g,21.38±1.20 VS 24.68±1.96g,p 值均小于 0.01),高脂饮食饲养小鼠体重明显大于普通饮食饲养小鼠(3.4±0.71g VS 9.1±2.25g,p=0.000),应用维格列汀处理的高脂饮食组小鼠体重增长明显低于未予维格列汀组(9.1±2.25g VS 3.3±1.51g,p=0.000),提示应用维格列汀后小鼠体重有明显下降。2.维格列汀不增加肝脏损伤风险与单纯高脂饮食组小鼠相比,应用维格列汀12周后,小鼠的肝/体重比明显下降(2.81±0.62%VS 3.37±0.07%,p<0.05)。小鼠血液学检测发现,高脂饮食饲养小鼠血清ALT、AST浓度分别为37.22±4.51 U/L、168.12±21.76 U/L,给予维格列汀的高脂饮食小鼠浓度分别为43.24±16.79 U/L、180.19±36.68 U/L,较单纯高脂饮食组无明显变化(p>0.05)。3.维格列汀改善高脂饮食小鼠胰岛素抵抗高脂饮食饲养小鼠应用维格列汀后血糖下降趋势(7.46±1.22mmol/L VS 7.70±1.34mmol/L),但无统计学意义(p>0.05)。对小鼠进行口服葡萄糖耐量实验发现,应用维格列汀后,30、60、90、120分钟各点血糖均较高脂饮食组小鼠组降低(数值分别为9.75±1.10 vs.11.03±1.73,9.01±0.97 vs.10.157±1.45,8.48±1.10 vs.9.99±1.76,8.09±1.11 vs.9.49±1.33,p 分别为 0.04、0.03、0.02 和 0.02),静脉胰岛素检测发现,应用维格列汀组胰岛素较高脂饮食组有所下降(172.91±43.28 nIU/mL vs.209.93±38.52 nIU/mL),但没有统计学意义,p=0.11。应用维格列汀后,小鼠稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)较单纯高脂饮食组有所下降(0.06±0.02 VS 0.07±0.03,p=0.04)。4.维格列汀降低高脂饮食小鼠LDL水平自动生化分析测试小鼠血液样本显示,维格列汀处理小鼠的LDL(0.47±0.07mmol/L)较高脂饮食小鼠明显降低(后者浓度为0.70±0.17mmol/L,p<0.01),TC有下降趋势(3.99±0.64mmol/L VS 3.87±0.97mmol/L,p>0.05),血清HDL和TG水平与高脂饮食组无明显差异(分别为2.73±0.47mmol/L VS 2.36±0.46mmol/L,0.25±0.09mmol/L VS 0.23±0.05mmol/L),p 分别为 0.21 和 0.21。5.维格列汀降低高脂饮食小鼠肝脏脂质含量HE染色显示不同干预组的肝脏结构均正常。不同组小鼠肝脏脂质含量表明,维格列汀喂养组小鼠校正后的FC较单纯高脂饮食喂养组明显降低(56.52±12.70 umol/g protein,p=0.031),但校正后 TG 仅有下降趋势(分别为 179.35± 198.41 VS umol/g protein),没有统计学意义(p=0.51),可显著降低肝脏中的总胆固醇(116.7±44.38 umol/g protein,p<0.05)。蛋白质印迹显示,高脂饮食联合维格列汀组中HMGCR和CTP7A1的表达较单纯高脂饮食组升高。6.维格列汀促进CYP7A1和HMGCR的表达无论是否应用维格列汀处理,细胞中游离胆固醇、总胆固醇、甘油三酯含量均无显著差异(p>0.05)。Western印迹显示维格列汀可增加细胞CYP7A1和HMGCR的蛋白表达,提示维格列汀可促进CYP7A1和HMGCR的表达。结论1.维格列汀减轻高脂饮食导致的小鼠糖耐量异常和胰岛素抵抗;2.维格列汀部分改善高脂饮食导致的小鼠血脂异常和肝脏脂质异常;3.维格列汀同时促进HMGCR和CYP7A1的表达,这一作用并不依赖GLP-14.维格列汀并不能改变HePG2细胞的脂质。研究目的糖尿病是一种慢性非传染性疾病,给社会和家庭带来极大经济负担。无论是在全球还是在中国,糖尿病患者的例数均不断增加。众所周知,胰岛素代谢异常会导致甲状腺功能异常,同样,甲状腺激素失衡也会影响胰岛素的代谢。研究表明患有甲状腺功能亢进症的糖尿病患者更容易罹患高血糖危象、反复发作的低血糖症。与血糖正常人群相比,2型糖尿病(T2DM)患者的血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)和促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)血清水平更高,并且原发性甲状腺功能减退症的患病率更高。在葡萄糖代谢中,甲状腺功能亢进症患者在禁食条件下葡萄糖水平更高。中国是人口最多的国家之一,成年人中糖尿病和糖尿病前期的患病率分别高达11.6和50.1%,已有研究探讨糖尿病患者的甲状腺疾病患病率,但是研究观察对象局限于糖尿病患者,糖尿病前期患者甲状腺疾病的患病率关注较少,糖代谢异常者甲状腺疾病的危险因素尚不可知。为明确不同血糖状态人群甲状腺疾病的患病率,本研究调查了山东宁阳地区人群中甲状腺疾病的患病率,分析异常血糖状态亚临床甲状腺功能减退人群心脑血管疾病(Cardio-Cerebral-Vascular Disease,,CC VD)的患病率,初步探讨不同血糖代谢状态下甲状腺疾病的危险因素。研究方法研究对象:本研究是一项基于人群的大规模、观察性、横断面研究。研究对象来自于2011年在中国进行的REACTION研究,研究方案已获得上海交通大学伦理委员会的批准。对满足纳入标准的受试者通过一站式流行病学调查完成信息采集,包括填写调查问卷、接受体格检查及采集隔夜空腹血样,否认糖尿病史的受试者还需要采集口服葡萄糖耐量2小时血糖。研究对象的纳入和排除标准如下:(1)纳入标准:在山东省宁阳县居住满5年且年满18周岁,同意并签署知情同意书。(2)排除标准:①孕期或产后六个月内;②在过去3个月内服用可能影响甲状腺功能的药物(包括甲状腺激素和抗甲状腺药物);③患有可能影响甲状腺功能的疾病,如精神疾病、急性心脑血管疾病、恶性肿瘤等、下丘脑-垂体疾病疾病。④严重肝、肾功能不全(见疾病诊断);⑤缺少与研究相关的重要数据,例如血清葡萄糖或甲状腺功能结果;⑥血糖正常人群中明确患有心血管疾病,包括脑卒中,心肌梗塞(myocardial infarction,MI),高血压病,冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary atherosclerotic heart disease,CHD)。实验方法:调查人员具有医学背景,均经过标准化培训,考核合格后进行调查问卷、体格检查、血液标本采集及检测等检查。所有血清标本于冰箱-20℃以下超低温保存、运输,于山东省立医院临床实验室完成相关检测。应用电化学发光法(Chemiluminescent methods,Cobas E601;Roche,Basel,Switzerland)定量检测甲状腺功能相关指标,包括促甲状腺激素、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸;应用贝克曼化学分析仪AU5800系统(BECKMAN Chemistry AnalyzerAU5800 System,Beckman Coulter,Tokyo,Japan)检测甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、空腹血糖、2h血糖(部分受试者)、谷丙转氨酶、门冬氨酸转氨酶、肌酐及糖化血红蛋白。上述血清学检测的批内差异和批间差异均控制在5%以下。根据美国糖尿病协会2010年的标准、《中国甲状腺疾病诊治指南》及临床正常实验室参考范围进行疾病诊断。统计分析:应用 SPSS 22.0 软件(SPSS version 22.0 for Windows,Chicago,IL,USA)进行统计分析。分类变量用频率(百分比)描述,正态分布的数值变量用平均值±SD表示。根据情况选择卡方检验(分类变量)、t检验或方差分析(数值变量)。应用多元logistic回归分析确定哪种血糖水平与甲状腺疾病最相关。显著差异切点为 p<0.05。结果1.受试者的基本临床特征本研究共纳入10,860名受试者,其中男性4437名(40.86%),女性6423名(59.14%),平均年龄为55.37±8.82岁。在这些受试者中,血糖正常人群为13.63%,58.80%为糖尿病前期患者,27.57%为糖尿病患者。2.血糖异常受试者的甲状腺疾病患病率更高在所有纳入的受试者中,甲状腺疾病患病率为13.43%(n=1459)。血糖异常人群甲状腺疾病患病率高于血糖正常人群(14.28%vs.8.11%,p<0.001)。在甲状腺疾病患者中,亚临床甲减患者最多,有1267例,占86.84%,随后依次为甲减(7.47%)、亚临床甲亢(3.63%)、甲亢(2.06%)。进一步将亚临床甲亢归入甲亢、亚临床甲减归入甲减统计,血糖异常人群中不同甲状腺疾病的比例与血糖正常人群明显不同(p<0.001)。3.性别、年龄和HDL是糖尿病受试者发生亚临床甲减的危险因素在罹患糖尿病的受试者中,合并亚临床甲减者女性比例高于甲功正常者(61.36%vs.54.26%,p<0.05);前者年龄小于后者(56.68±8.21 岁 vs.57.84±8.63 岁,P<0.05)。合并亚临床甲减的糖尿病受试者TG水平(2.43±3.38 mmol/L)高于甲功正常的糖尿病受试者者(1.80±1.40 mmol/L,P<0.01),两组在 TC(5.61±1.38 mmol/L vs.5.30±1.23 mmol/L)和 LDL(3.34±1.02 mmol/L vs.3.16±0.95 mmol/L)间也有明显差别(p 均<0.01),但 HDL 在两组间无差别(1.36±0.36 mmol/L vs.1.38±0.35 mmol/L,p=0.21)。合并亚临床甲减的糖尿病受试者与甲功正常的糖尿病受试者在HbA1c、FBG和PPG方面均无差异。女性和年龄是糖尿病受试者的危险因素,OR分别为为2.53[95%CI为(1.99-3.27)]和1.01[95%CI(1.00-1.03)]。高密度脂蛋白胆固醇(HDL)水平较低的糖尿病患者更容易罹患亚临床甲减[OR为0.562,95%CI(0.388-0.815)]。4.性别和年龄是糖尿病前期受试者发生亚临床甲减的危险因素在糖尿病前期的受试者中,合并亚临床甲减者女性比例较甲功正常者更高(63.91%vs.58.28%,p<0.01),前者年龄大于后者(56.82±8.18 岁 vs.54.84±8.71岁,P<0.01)。合并亚临床甲减的糖尿病前期受试者HbA1c、TG、TC和LDL分别高于甲功正常的糖尿病前期受试者(分别为5.87±0.29%vs.5.82±0.31%,1.50±1.03 mmol/L vs.1.37±1.01 mmol/L、5.28± 1.18 mmol/L vs.5.07±1.11 mmol/L、3.17±0.93 mmol/L vs.3.00±0.87 mmol/L,p均小于0.01,HDL低于后者(1.42±0.33 mmol/L vs.1.46±0.37 mmol/L,p<0.01)。女性是糖尿病前期受试者的危险因素,OR为2.55[95%CI为(2.15-3.02)]。随着年龄的增加,糖尿病前期受试者罹患亚临床甲减的风险明显增加,OR为1.01,95%CI(1.00-1.02)]。5.糖尿病合并亚临床甲状腺功能减退的CCVD患病率最高合并亚临床甲减的糖尿病受试者CCVD发生率(33.97%)明显高于不合并者(26.51%),差异有统计学意义(P<0.01),也高于糖尿病前期受试者(33.97%vs.16.78%;P<0.01)。糖尿病前期受试者合并亚临床甲减者CCVD发生率(16.78%)高于未合并者(15.87%),但是没有统计学差异(P=0.56)。结论1.糖代谢紊乱者甲状腺疾病患病率高于血糖正常人群。2.罹患甲状腺疾病的糖代谢紊乱者中,亚临床甲减人群最多(86.84%),其次是甲减(7.47%)、亚临床甲亢(3.63%),甲亢的比例最小,为2.06%。3.女性和年龄是罹患亚临床甲减的危险因素,糖尿病患者中,高密度脂蛋白降低是合并亚临床甲减的危险因素。4.合并亚临床甲减的糖尿病患者,CCVD的患病率高于单纯糖尿病患者。