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目的：本实验通过分别构建针对HPV16E6、E7和HPV18E6、E7的microRNA(miRNA)干扰载体并转染HPV16阳性的宫颈癌细胞株SiHa和HPV18阳性的HeLa细胞，抑制癌基因E6、E7的表达，观察E6、E7基因沉默对上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的相关基因——β-catenin、E-cadherin和N-cadherin和Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，分析HPV与宫颈癌细胞发生EMT的相关性，阐明HPV导致宫颈细胞发生EMT的可能信号通路机制，为以HPV为靶点的宫颈癌的基因治疗提供系统的理论依据。方法：1.培养HPV16阳性的人宫颈癌细胞株SiHa和HPV18阳性的人宫颈癌细胞株HeLa。2.miRNA干扰质粒的构建及质粒提取：分别构建针对HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7的miRNA干扰质粒，以及1个阴性对照microRNA干扰质粒。分别中提各质粒以用于瞬时和稳定转染过程。3.瞬时转染和转染效率的测定：利用脂质体转染技术分别转染人宫颈癌细胞株SiHa和HeLa，瞬时转染48小时后通过倒置荧光显微镜观察细胞并计数，计算转染效率。4.稳定转染：构建的干扰载体含对杀稻瘟菌素的抗性，故分别用不同浓度的杀稻瘟菌素作用于宫颈癌细胞SiHa和HeLa，确定宫颈癌细胞SiHa和HeLa的筛选浓度及维持浓度；进而建立相应的稳定转染的细胞。5.实时定量PCR(Real-Time PCR)技术检测各组靶基因的干扰效率：分别以SiHa和HeLa细胞为阴性对照，检测各干扰质粒和阴性对照质粒转染宫颈癌细胞后对各自靶基因HPV16E6和E7、HPV18E6和E7mRNA表达的影响，计算各自的干扰效率，筛选出干扰效率最高的质粒用于后续实验。6.EMT相关基因的检测：为进一步研究HPV与宫颈癌EMT的相关机制，利用Real-Time PCR技术，检测HPV被干扰前后Wnt1、β-catenin、E-cadherin及N-cadherin的表达情况，分别以未转染的SiHa和HeLa细胞为阴性对照。结果：1.倒置相差显微镜观察人宫颈癌细胞株SiHa和HeLa均生长旺盛，细胞形态呈现多样化。2.倒置荧光显微镜观察和计数用各干扰质粒及阴性对照质粒瞬时转染48小时后荧光阳性细胞占所有细胞的比例，转染效率可达70-80%。3.干扰效率的检测：针对SiHa细胞系，以未转染的SiHa细胞为阴性对照，各组分别以各自的GAPDH为内参照，Real-Time PCR技术检测发现转染干扰质粒HPV16E6-miRNA后，HPV16E6mRNA的表达量较SiHa细胞组降低，对HPV16E6的干扰效率达77.8%，而经HPV16E7-miRNA2、HPV16E7-miRNA4转染后HPV16E7mRNA的表达量较SiHa细胞组降低，对HPV16E7的干扰效率分别为67.3%和59.4%，可见HPV16E7-miRNA2具有更高的干扰效率。而转染阴性对照质粒(Neg-miRNA)组与SiHa细胞相比，HPV16E6和E7mRNA的表达均无明显变化(P>0.05)，说明阴性对照质粒不影响SiHa细胞HPV16E6和E7mRNA的表达。针对HeLa细胞系，以未转染的HeLa细胞为阴性对照，以GAPDH为内参照，Real-Time PCR检测示转染HPV18E6-miRNA后，HPV18E6mRNA的表达量较HeLa细胞组降低，对HPV18E6mRNA的干扰效率达87.3%，而经HPV18E7-miRNA1、HPV18E7-miRNA4转染后HPV18E7mRNA的表达量较HeLa细胞组降低，对HPV18E7的干扰效率分别为68%和45.5%，可见HPV18E7-miRNA1具有更高的干扰效率。而转染阴性对照质粒(Neg-miRNA)组与HeLa细胞相比，HPV18E6和E7mRNA的表达均无明显变化(P>0.05)，说明阴性对照质粒不影响HeLa细胞HPV16E6和E7mRNA的表达。说明HPV18E6-miRNA和HPV18E7-miRNA1能高效的转染人宫颈癌细胞株HeLa，并分别使靶基因HPV18E6和E7在mRNA水平上受到了抑制。故可用质粒HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA2、HPV18E6-miRNA、HPV18E7-miRNA1、Neg-miRNA作为后续稳定转染的目的质粒。4.SiHa和HeLa细胞筛选浓度和维持浓度的确定：经含不同浓度的杀稻瘟菌素的培养基培养10天的SiHa和HeLa细胞，均在杀稻瘟菌素浓度≥9ug/ml时全部死亡，故确定用于稳定转染的筛选浓度为10ug/ml，维持浓度为5ug/ml。5.EMT相关基因的表达检测：①E-cadherin和N-cadherin的表达情况：Real-Time PCR结果示SiHa和HeLa细胞中E-cadherin均低表达，而N-cadherin均高表达。敲除HPVE6、E7基因后的SiHa和HeLa细胞E-cadherin表达均明显升高，N-cadherin的表达均明显降低，P均<0.05。同样，较未转染组阴性对照质粒组无明显变化，提示干扰HPV E6、E7基因的表达可使E-cadherin的表达上调、N-cadherin的表达下调，因而HPVE6、E7与宫颈癌发生EMT相关。②Wnt1和β-catenin的表达情况：以未转染的SiHa和HeLa细胞为阴性对照，以管家基因GAPDH为内参，利用Real-Time PCR技术检测各转染组细胞中Wnt1和β-catenin的表达变化。SiHa细胞经HPV16E6-MiRNA、HPV16E7-MiRNA2转染后较未转染组Wnt1和β-catenin表达均明显降低(P均<0.05)。同样，在HeLa细胞中经HPV18E6-MiRNA、HPV18E7-MiRNA1转染的细胞的Wnt1和β-catenin的表达发生同样变化，而阴性对照质粒则无明显变化，提示干扰HPV E6、E7基因的表达可抑制Wnt1和β-catenin的表达，因而在宫颈癌中HPVE6、E7可激活EMT的信号通路之一——经典的Wnt/β-catenin信号通路，促进宫颈癌的发生。结论：1.成功构建了针对HPVE6、E7的miRNA干扰载体，同时筛选出了有效的干扰质粒，可以直接干扰细胞内目的基因的表达，而阴性对照质粒则不引起相应变化，对细胞内原有基因的表达无明显作用；同时筛选出了相应的稳定转染细胞株，为进一步研究HPVE6、E7对宫颈癌的影响提供了实验基础。2.HPVE6、E7基因被干扰后上皮性标志物E-cadherin表达上升，间质性标志物N-cadherin表达下降，发生了间质-上皮转化，表明在宫颈癌的发生过程中存在EMT，且这一过程与HPVE6、E7表达升高有关。3.HPVE6、E7基因被干扰后，Wnt信号通路中的Wnt1和β-catenin明显降低，表明在宫颈癌中HPVE6、E7基因可通过激活经典的Wnt/β-catenin信号通路诱导宫颈细胞发生EMT。